В марте 1863 года Петр Лесгафт получает должность сверхштатного ординатора в главном военно-сухопутном госпитале в клинике профессора А.А. Китера и одновременно читает лекции по анатомии студентам 5-го курса Медико-хирургической академии. 29 мая 1865 года П Ф. Лесгафт блестяще защитил диссертацию на степень доктора медицины. «Диссертация его есть одна из лучших, которые когда-либо появлялись в Медико-хирургической академии», — писал Грубер. — Она основывается на огромном числе исследований и составлена с большой точностью и любовью к научной истине».
Через три года появляется статья Лесгафта «Колотомия в левой поясничной области с анатомической точки зрения». Его высокая анатомическая техника, несомненные преподавательские способности и появившиеся в печати первые научные труды обратили на себя внимание руководителей медицинского факультета Киевского университета, и он был приглашен туда на кафедру анатомии. К этому же времени был объявлен конкурс на должность заведующего кафедрой физиологической анатомии в Казанском университете. П Ф. Лесгафт направляет туда требуемые документы, и 11 сентября 1868 года девятью голосами против одного совет университета избирает его экстраординарным профессором.
В Казанском университете профессор Лесгафт совершает неординарный поступок. Для помощи в приготовлении учебных препаратов и проведении практических занятий он вначале привлекал студентов старших курсов, но в сентябре 1870 года он добился официального прикрепления к кафедре ученицы повивального класса Евгении Мужсковой. Так, впервые в России женщина надела прозекторский фартук и встала рядом с мужчинами. Петру Францевичу принадлежит идея создания антропологического музея, который благодаря его стараниям стал быстро пополняться ценными экспонатами. Три года, проведенных Петром Францевичем в Казанском университете, оставили заметный след. «Один из самых ярких анатомов, каких производил свет» — так написала о нем в декабре 1870 года казанская газета «Неделя».
«Дело Лесгафта», вызвавшее большое волнение научной общественности России, совпало по времени с событиями, смертельно напугавшими царское правительство: в сентябре 1870 года во Франции началась революция, приведшая к падению империи и созданию республики. Началось оно на уже подготовленной почве неприязни к попечителю П.Д. Шестакову. Толчком же послужили экзамены, которые вместо профессора Лесгафта принял профессор патологической анатомии А.К. Петров. При разборе дела в совете университета выяснилось, что экзамены были проведены с нарушением требований, без препарирования трупа. Возмущенный этим обстоятельством, Петр Францевич написал письмо в газету, в которой вышла сенсационная статья «Что творится в Казанском университете». Так был вынесен сор из университетской избы на двор всей России. Скомпрометированный П.Д. Шестаков добился у царя увольнения профессора Лесгафта без права преподавания.
Остро переживая вынужденный отрыв от научно-практической и преподавательской работы, Петр Францевич с неофициального разрешения Петербургского градоначальника П.А. Грессера открыл у себя на квартире бесплатное чтение лекций по анатомии, знаменитые «курсы Лесгафта», которые на протяжении всех последующих тридцати с лишним лет привлекали к себе сотни молодых умов.
К этому времени относится начало работы П.Ф. Лесгафта над теорией и практикой физического образования. Пожалуй, впервые он серьезно заинтересовался этими вопросами в 1872 году, когда поступил врачом-консультантом в частное врачебно-гимнастическое заведение доктора А.Г. Берглинда. Заведение это было одним из немногих, где на гимнастику смотрели как на отрасль врачебной науки и для правильного ее проведения считали необходимым знание анатомии и физиологии человека.
Доктор медицины А. Г. Берглинд получил образование в Стокгольме в Центральном гимнастическом институте. В 1848 году он прибыл в Петербург, где и остался, занявшись организацией занятий врачебной гимнастикой. Он считался опытным кинезотерапевтом, то есть врачом, который лечит движениями, и его врачебно-гимнастическое заведение пользовалось широкой популярностью. П.Ф. Лесгафт был знаком с двухтомным трудом Берглинда «Врачебная гимнастика по системе шведского гимназиарха Линга» — первый солидной работой такого плана, изданной в России в 1860 году. Надо полагать, что Петра Францевича привлекало стремление автора поставить преподавание гимнастики на научную основу, фундамент которой должны составлять анатомия и физиология. Увлеченный открывшейся возможностью использовать скрытые резервы гимнастики, сделать ее максимально полезной, особенно для детского и юношеского организма, профессор Лесгафт обратился в Главное управление военно-учебных заведений и предложил свои услуги. Его предложение было принято, и с декабря 1847 года он приступил к занятиям гимнастикой с воспитанниками 2-й Петербургской военной гимназии.
Убедившись в большом педагогическом мастерстве, с которым Лесгафт проводил занятия, в его увлеченности и энергии, директор гимназии предложил ему официально перейти из Медицинского департамента на постоянную службу при Главном управлении военно-учебных заведений. 15 марта 1875 года Медицинский департамент дал согласие на переход в качестве чиновника по особым поручениям. Первое такое «особое поручение» было уже согласовано с ним заранее и состояло в том, что в течение 1875–1876 годов с конца марта до конца октября П.Ф. Лесгафт ежегодно командировался за границу"…для подробного ознакомления с педагогической гимнастикой и с учреждениями для специального приготовления учителей этого искусства». В остальные месяцы Петр Францевич продолжал свои специальные занятия с отдельными группами воспитанников 2-й Петербургской военной гимназии по немецкой и шведской системам, а также по системе, предложенной им самим.
В это время в России была введена приват-доцентура, позволяющая желающим проявить свои научные познания и преподавательские способности и впоследствии иметь возможность занять штатное место профессора. Воспользовавшись этим обстоятельством и освободившись наконец от запрета преподавать, П.Ф. Лесгафт обратился к попечителю Петербургского учебного округа с просьбой разрешить ему читать лекции по анатомии в качестве приват-доцента.
Прошение было удовлетворено, и 24 сентября 1886 года Петр Францевич занял место за университетской кафедрой. Начался новый этап его преподавательской деятельности — десять лет работы в прославленном столичном университете на физико-математическом факультете, в состав которого входила и кафедра зоологии, анатомии и физиологии.
По достоинству оценив значение открытия В. Рентгена, он одним из первых стал использовать новый метод — рентгенологическое исследование для изучения внутренних органов и суставов.
П.Ф. Лесгафт был одним из основоположников лечебной гимнастики в нашей стране. Многие приемы, применявшиеся им для коррекции врожденных и приобретенных дефектов развития костно-мышечной системы у детей, успешно используются и в настоящее время. Вместе с Ф.Ф. Эрисманом и А.П. Доброславиным он разработал основы школьной гигиены и участвовал в практическом внедрении их в некоторые учебные заведения Петербурга. Он принимал участие в создании кабинета гигиены, ставшего первым в России гигиеническим музеем.
Написанная П.Ф. Лесгафтом в 1870 году «Инструкция для измерения живого человека» была первым отечественным руководством по врачебному контролю, практическое обучение которому он проводил на открытых им учебно-гимнастических курсах. Созданная им Биологическая лаборатория явилась одним из первых в России научно- исследовательских институтов, в котором в советское время работали такие крупные ученые-академики, как Л.А. Орбели, А.А. Борисяк, В.Н. Любименко, В.А. Омелянский и др.
Труды Петра Францевича сыграли важную роль в развитии научных основ прогрессивной педагогики. «Руководство по физическому образованию детей школьного возраста» было первой фундаментальной работой, в которой физическое воспитание и образование строятся на научных основах с учетом анатомо-физиологических и психологических особенностей учащихся.
Велики заслуги профессора Лесгафта в деле женского медицинского образования, страстным защитником которого он был всю жизнь.
Неоценима роль Петра Францевича в Деле развития физической культуры в нашей стране. После революции 1917 года на базе созданных и руководимых им курсов воспитательниц и руководительниц физического образования был открыт Государственный институт физического образования, ныне Государственный институт физической культуры им. П.Ф. Лесгафта. В 1959 году на территории института был сооружен памятник П.Ф. Лесгафту.
Осенью 1909 года Петр Францевич Лесгафт простудился и тяжело заболел. Болезнь дала осложнения на почки, и врачи настойчиво рекомендовали ему сухой жаркий климат и санаторное лечение. В Гелуани находился санаторий, которым руководили русские врачи. Туда и решили отвезти П.Ф. Лесгафта. К сожалению, болезнь зашла слишком далеко. 28 ноября 1909 года Петра Францевича не стало. Хоронили его в Петербурге при огромном стечении народа.