Методы рентгеноструктурного анализа позволяют воссоздать пространственную структуру молекулы белка (в обсуждаемом случае – вместе с молекулой связывающегося с ней ингибитора) с точностью до положения отдельных атомов. Благодаря этому стали ясны многие конкретные подробности актов ферментативного катализа. Однако ферменты (и их комплексы с ингибиторами) сравнительно легко выделить в достаточных количествах, а затем получить в кристаллическом виде («закристаллизовать», говорят профессионалы).
Совершенно иным образом обстоит дело с рецепторами – даже наиболее хорошо изученными. Чаще всего, по-видимому, рецептор – это не одна молекула, а сложное образование, состоящее из нескольких молекул, встроенных в мембрану. Преимущественно это белковые молекулы, но не только. Чаще предполагается, что с молекулой биорегулятора непосредственно взаимодействует именно белковый компонент. В настоящее время выделены рецепторные белки ряда биорегуляторов, однако достаточно подробный рентгеноструктурный анализ комплекса гормона с его специфическим рецептором – все еще дело будущего.
И все же, если нельзя получить сведения о пространственной организации связывающего центра рецептора прямыми экспериментальными методами, не следует ли поискать каких-либо косвенных подходов?
Возможны такие подходы, часто очень интересные. Суть их заключается в том, чтобы, варьируя различные элементы структуры молекулы биорегулятора, испытывать биологическую активность (точнее, способность взаимодействовать со специфическими рецепторами) вновь полученных соединений. Исследователь приобретает возможность как бы ощупывать поверхность рецептора. Так же, по-видимому, действует и взломщик, пытающийся сообразить, какую же конфигурацию должен иметь ключ, открывающий интересующий его замок: испытывает разные «пробные» ключи и отмечает, какой именно выступ мешает ключу провернуться.
В принципе, подобного рода идеологию поиска аналогов биологически активных соединений некоего класса можно проследить еще в работах П. Эрлиха и Э. Фишера, но как реализовать такие подходы на практике?
«...Любое эффективное антибактериальное действие должно включать взаимодействие антибиотика с макромолекулой, будь то белок, нуклеиновая кислота или липид... Это достаточно важный вопрос, поскольку потенциальное летальное действие заключается во взаимодействии двух молекул, одна из которых часто на один или два порядка больше по молекулярному весу, чем другая. Более того, поскольку молекулярная архитектура большей части белков исследована довольно мало, а еще меньше изучена структура нуклеиновых кислот и липидов, один компонент реакционной смеси всегда охарактеризован недостаточно; особенно это касается конкретных химических группировок, взаимодействующих с антибиотиками. Такую ситуацию можно сравнить со схваткой с призраком!»
Это цитата из книги, написанной несколькими крупнейшими английскими фармакологами и вышедшей в 1972 году. Пятнадцать лет, при нынешних темпах развития биологических наук, – срок очень немалый, однако приведенное суждение почти не утратило актуальности. Почти – потому, что некоторые, пусть не очень радикальные сдвиги к лучшему за этот период все же произошли.
Возвратимся к задаче «ощупывания» рецептора аналогами молекулы биорегулятора с различными модификациями пространственной структуры.
Если введение в определенном положении громоздкого заместителя не лишает тем не менее полученный аналог биологической активности, значит, «прилипание» к рецептору происходит не этой стороной. Активность утрачена – по-видимому, введенный заместитель упирается во что-то на – поверхности рецептора, и т.д.
Для того чтобы на основании таких экспериментов можно было судить о поверхности рецептора, нужно знать пространственное строение молекулы природного биорегулятора и испытываемых «пробных» синтетических аналогов. Все дело, однако, в том, что молекулы почти всех природных биорегуляторов – гибкие, обладающие значительной внутримолекулярной подвижностью. Как известно, многие органические молекулы могут изменять пространственную структуру в результате вращения одной своей части относительно другой вокруг одинарных связей. Правда, из-за отталкивания отдельных атомов друг от друга такое вращение несвободно, и если молекула не слишком велика, она может принимать обычно лишь действительно небольшое количество пространственных структур (называемых ротамерами или конформерами). Существуют расчетные методы, позволяющие осуществить нахождение таких структур (в том случае, если молекула не очень велика: состоит из нескольких десятков, от силы сотни атомов).
В основе расчетов лежит нахождение таких структур, которым соответствуют минимумы энергии внутримолекулярных взаимодействий. Задача заключается в отыскании конформаций, которым соответствуют минимумы суммарной энергии взаимодействия всех пар атомов.
Не будем вдаваться в подробности способов ее решения; можно лишь отметить, что такие расчеты чрезвычайно громоздки и требуют подчас нешуточных затрат времени ЭВМ. На протяжении многих лет мне приходилось заниматься подобного рода задачами; всякий раз, когда наступал срок нести в бухгалтерию очередной счет за машинное время, я с тоской ожидал момента, когда главбух, глянув на графу «сумма к оплате», переведет взгляд на меня. Иногда в этом взгляде была тихая, светлая скорбь, временами–оторопь с оттенком возмущения.
Я полагаю, что подобное происходит с моими коллегами – специалистами по теоретическому конформационному анализу биологических молекул во всем мире. Дело здесь вовсе не в их испорченности или скверном характере представителей финансовых служб, а в самом характере решаемых задач. Подобному расчету доступны лишь не очень большие молекулы, содержащие от силы сотни атомов. Так вот, граница этой доступности определяется именно затратами машинного времени. При этом зачастую увеличение размеров молекулы (то есть числа образующих ее атомов) всего на десять процентов требует десятикратного увеличения затрат времени ЭВМ на ее решение. Так что ни рост быстродействия вычислительных машин на три-четыре порядка, ни подешевение машинного времени радикально ничего не меняют: аппетиты исследователей всегда и повсюду ограничиваются так называемым «разумным пределом затрат». К сожалению, не существует способов точного вычисления этого предела, откуда и берутся упомянутые разногласия в его оценке между исследователями и финансовыми работниками.
Пусть, впрочем, все вычислительные, технические и финансовые трудности преодолены и мы располагаем сведениями о наборах стабильных конформаций интересующих нас соединений. Что же дальше?
Если поверхность рецептора представляет собой слепок с молекулы биорегулятора, а эта молекула может существовать в виде нескольких пространственных форм, возникает вопрос: а какая же из этих форм необходима для связывания с рецептором? Или, иначе, слепок с которой формы представляет собой рецептор?
Конформацию, которую молекула биорегулятора приобретает в составе комплекса с рецептором, называют продуктивной, или, на мой взгляд, довольно неудачно, биологически активной конформацией. Каким же образом выявить такую конформацию, не имея в своем распоряжении прямых экспериментальных методов?
Общая схема этой процедуры такова. Синтезируется серия аналогов исследуемого биорегулятора, каждый из которых получается незначительной модификацией его структуры, ограничивающей, однако, конформационные возможности молекулы. Иными словами, молекула такого аналога оказывается неспособной принимать ряд конформаций, характерных для природного соединения. Какие именно конформаций исключаются, можно установить с помощью такого же расчета или даже «на глаз», исходя из сравнительно простых стереохимических закономерностей.
Если полученный аналог оказался активным, значит, исключенные в результате модификации структуры не являются продуктивными. Активность утрачена – следовательно, продуктивную конформацию следует искать среди «запрещенных». Располагая сведениями, относящимися к нескольким подобным аналогам, можно «отсеять» с помощью таких рассуждений ту конформацию, которая характерна для молекулы в составе комплекса с рецептором.
