Мне повезло отыскать двух фантастических людей. Одним из них был мой новый аспирант Эмлин Парфитт, другим — постдок Маркус Бишофф, временно перешедший к нам из команды Питера Лоренса. Маркус трудился «в две смены», часть времени посвящая эмбрионам плодовых мушек дрозофил и часть времени — работе со мной, подобно тому, как я сама в период постдокторских исследований разрывалась между мышиными и лягушачьими эмбрионами Мартина Эванса и лабораторией Джона Гёрдона. Получившиеся таймлапсы точно отслеживали окончательное местонахождение каждой клетки на двух-, четырех- и восьмиклеточных стадиях развития. Фильмы показывали судьбу клеток на протяжении нескольких дней, включавших несколько клеточных делений на стадии бластоцисты — полого шарика из клеток, почти готового к имплантации в матку.
В отличие от предыдущих работ, мы пользовались не только глазами и мозгом, но и специальным программным обеспечением для отслеживания клеток. Что было важно, поскольку исключало любую предвзятость, даже неосознанную, при оценке судьбы индивидуальных клеток, когда мы анализировали наши фильмы. Это также сильно облегчало слежение за отдельными клетками. Анализ выполнялся Маркусом и Эмлином, которые независимо друг от друга оценивали каждый эмбрион и положение каждой клетки.
Это было огромное командное усилие, Маркус с Эмлином полностью вложились в проект. Для меня это означало воплощение долгожданной мечты, и мне не терпелось узнать, что они обнаружили. Сама я не могла помочь с анализом данных, поскольку моя вторая беременность оказалась не такой легкой, как первая.
Точные трехмерные фильмы выявили множество важных деталей развития от момента, когда эмбрион состоит всего из двух клеток, до превращения в бластоцисту. Яркие флуоресцентные следы подтвердили все наши предыдущие результаты. Они поддержали идею о том, что одна клетка двухклеточного эмбриона склонна развиваться в эмбриональную часть бластоцисты, из которой формируется собственно эмбрион, а вторая склонна генерировать внеэмбриональные ткани. Они показали, что этот уклон зависит от ориентации и порядка деления, начиная с двухклеточной и заканчивая четырехклеточной стадией, и влияет на последующие паттерны клеточного деления. Мы считали, что это потрясающее исследование, и представили наши документальные фильмы вместе с подробным анализом в Nature.
Они были отправлены на рецензию, но пока мы подготавливали наш манускрипт к публикации, в журнале Science вышла статья, тоже содержащая таймлапсы с мышиными эмбрионами, однако эти фильмы предлагали альтернативное объяснение, что эмбриональный паттерн завит от формы zona pellucida [18]. Как следовало ожидать, наш материал отклонили.
Я только что родила Саймона, и понадобилось время, чтобы расширить исследования и понять, почему наши результаты отличались от опубликованных в Science. (Позже это конкретное открытие было опровергнуто Ричардом Гарднером [19].) Со временем мы расширили исследования и в 2008 году представили дополнительные доказательства в поддержку нашей работы. Отслеживая по таймлапсам родословную каждой клетки, мы увидели, что по пути к бластоцисте на паттерн симметричных/асимметричных клеточных делений влияло происхождение клеток относительно анимально-вегетативной оси оплодотворенной яйцеклетки и плоскости первого дробления [20]. Я употребляю слово «влияло» не без причины, снова подчеркивая, что это скорее, тенденция, чем предопределенность, поскольку развитие мыши пластично.
Для получения действительно связной истории о причинах нарушения симметрии нам, помимо экспериментов с отслеживанием клеток, требовалось разобраться в деталях фундаментальных генетических инструкций, направляющих этот танец.
Каков же механизм?
Со временем коллеги начали открыто признавать, что за результатами наших исследований структуры ранних эмбрионов скрывается нечто важное. Однако у них возникали вопросы. В чем заключается механизм? Существуют ли ген или какие-то эпигенетические изменения, которые запускают процесс, влияющий на судьбу клеток в начале развития? Если да, можно ли их обнаружить?
(window.adrunTag = window.adrunTag || []).push({v: 1, el: 'adrun-4-390', c: 4, b: 390})
Для проведения исследований по идентификации механизма мы нуждались в финансовой поддержке. Которую так и не получили. Всякий раз при подаче заявки на финансирование тот или иной анонимный рецензент отвечал, что у нас нет доказательств того, что клетки на такой ранней стадии отличаются друг от друга, следовательно, нет необходимости искать механизм. Трудно поверить, сколько заявок на грант было отклонено таким образом и сколько месяцев было впустую потрачено на их написание. Продвинуться вперед мы смогли только благодаря случайному открытию, автором которого была потсдокторский исследователь Мария-Елена Торрес-Падилья, присоединившаяся к моей группе после защиты диссертации в Институте Пастера в Париже.
В то время моя лаборатория соседствовала с лабораторией моего друга, выдающегося биолога-онколога Тони Кузаридеса, который открыл несколько эпигенетических модификаций гистоновых белков, помогающих упаковывать в хромосомы клеточную ДНК. Эти изменения влияют на то, какие гены будут считываться, и потенциально способны изменить клеточные характеристики. Под влиянием Тони (как косвенным, так и непосредственным) мы смогли установить важные эпигенетические различия между индивидуальными клетками эмбриона на четырехклеточной стадии.
Мария-Елена обнаружила разницу в метилировании двух специфических аргининовых (аргинин — это аминокислота, один из строительных блоков белка) остатков в гистоне H3 (типе гистоновых белков). Поначалу мы думали, что эта разница отражает различные фазы клеточного цикла, ведь клетки не делятся строго в такт. Но, к счастью для нас, эта разница оказалась действительно важной: наименьший уровень специфического метилирования присутствовал в клетке, которая, согласно нашим предыдущим результатам, была склонна дифференцироваться в трофэктодерму (формирующую плаценту, а не ребенка).
Но корреляция, какой бы идеальной она ни была, не подтверждает причинно-следственную связь. Чтобы убедиться, Мария-Елена ввела в одну из клеток двухклеточного эмбриона послание для фермента CARM1, прикрепляющего метальные группы к аргининовым остаткам на гистоне H3. Это единичное изменение сделало клетку более плюрипотентной, имеющей наивысший потенциал развития. Оно привело к повышенной экспрессии генов, кодирующих факторы плюрипотентности, — молекулярные переключатели SOX2 и NANOG, которые повышают способность клетки к дифференцировке. В результате клетка с повышенным уровнем CARM1 порождала клетки, превращающиеся в собственно эмбрион.
Это молекулярное переключение было просто поразительным. Наша работа предоставила первые сведения о механизме, склоняющем клетку эмбриона к дифференциации в трофэктодерму. Такая клетка обладала наименьшей активностью фермента CARM1. В 2007 году журнал Nature опубликовал наше открытие [21].
Исследование впервые приоткрыло молекулярный механизм, скрывающийся за неоднородностью мышиного эмбриона и нарушением его симметрии [22]. Оно показало, что клетки соревнуются за свою судьбу, а значит, некоторые клетки лучше других предрасположены к формированию собственно эмбриона, и это склоняет их на определенный путь развития. По чистой случайности статья была опубликована в тот самый день, когда в кембриджской больнице Рози родился мой сын Саймон. Это был еще один невероятно счастливый момент в моей жизни.
Истории одной клетки
Поскольку тогда меня заинтересовали другие темы, в моих поисках молекулярного механизма начального нарушения симметрии наступил многолетний перерыв. Однако несколько лет назад, когда у нас появилась возможность взглянуть на ранний эмбрион под новым и очень информативным углом, наш интерес к симметрии снова пробудился. Нас подстегнул успех коллег в области секвенирования нуклеиновых кислот, позволяющий прочитать все послания иРНК[14] индивидуальной клетки. Послания содержат инструкции по созданию белков, полученные от ДНК (клеточного хранилища генетической информации). Чтобы превратить код РНК-посланника в белок, клетка нанимает другой тип РНК — транспортную РНК, которая переносит строительные блоки белков, называемые аминокислотами. Зная о присутствии конкретных посланий, можно понять, какие гены в каждой клетке включаются и выключаются на ранних этапах жизни эмбриона.
