Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч, входящий в М., раздваивается; один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, а второй — мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви М. В окулярной части М. оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Результат интерференции определяется разностью хода лучей d, которая выражается формулой d = N l = (n0 — nm )d , где n0 , nm — показатели преломления частицы и окружающей среды, d — толщина частицы, N — т. н. порядок интерференции, l — длина волны света. Принципиальная схема одного из способов осуществления интерференционного контраста показана на рис. 6 . Конденсор 1 и объектив 4 снабжены двоякопреломляющими пластинками (помечены на рис. диагональными стрелками), первая из которых расщепляет исходный световой луч на два луча, а вторая воссоединяет их. Один из лучей, проходя через объект 3, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом); величина этого запаздывания измеряется компенсатором 5. Метод интерференционного контраста в некоторых отношениях сходен с методом фазового контраста — оба они основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод позволяет наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток (и часто применяются именно с этой целью). Отличие интерференционного метода от метода фазового контраста заключается главным образом в возможности, используя компенсаторы, с высокой точностью (до 1 /300 l) измерять разности хода, вносимые микрообъектами. Это открывает широкие возможности количественных исследований — на основании таких измерений могут быть рассчитаны общая масса и концентрация сухого вещества в микрообъекте (например, в растительной или животной клетке), показатель преломления и размеры объекта (рис. 7 ). Метод интерференционного контраста часто сочетают с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете; применение его совместно с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, например, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта. К интерференционной микроскопии обычно относят также методы использования микроинтерферометров .
Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) заключается в наблюдении под М. зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами (см. Люминесценция ). При этом методе в оптическую схему М. вводятся два светофильтра . Первый из них помещают перед конденсором; он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, установленный после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют как освещение препаратов сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света); его часто сочетают с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете.
Метод широко применяется в микробиологии , вирусологии , гистологии , цитологии , в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе , в дефектоскопии . Обилие и разнообразие применений связаны с чрезвычайно высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне, а также ценностью информации о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения.
Метод наблюдения в ультрафиолетовых (УФ) лучах позволяет увеличить предельную разрешающую способность М., т. е. понизить его предельное разрешение, которое зависит (см. выше) от длины волны l применяемого излучения (для используемых в микроскопии УФ лучей l = 400—250 нм, тогда как для видимого света l = 700—400 нм ). Но главным образом этот метод расширяет возможности микроскопических исследований за счёт того, что частицы многих веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ излучение определённых длин волн и, следовательно, легко различимы в УФ изображениях. Характерными спектрами поглощения в УФ области обладает, например, ряд веществ, содержащихся в растительных и животных клетках (пуриновые основания , пиримидиновые основания, большинство витаминов , ароматические аминокислоты , некоторые липиды , тироксин и др.); это обусловило широкое применение УФ микроскопии в качестве одного из методов цитохимического анализа.
Ультрафиолетовые лучи невидимы для человеческого глаза. Поэтому изображения в УФ микроскопии регистрируют либо фотографически, либо с помощью электроннооптического преобразователя или люминесцирующего экрана. Распространён следующий способ цветового представления таких изображений. Препарат фотографируется в трёх длинах волн УФ области спектра; каждый из полученных негативов освещается видимым светом определённого цвета (например, синим, зелёным и красным), и все они одновременно проектируются на один экран. В результате на экране создаётся цветное изображение объекта в условных цветах, зависящих от поглощающей способности препарата в ультрафиолете.
Метод наблюдения в инфракрасных (ИК) лучах также требует преобразования невидимого для глаза изображения в видимое путём его фотографирования или с помощью электроннооптического преобразователя. ИК микроскопия позволяет изучать внутреннюю структуру объектов, непрозрачных в видимом свете, например тёмных стекол, некоторых кристаллов и минералов и пр.
Микрофотографирование и микрокиносъёмка, т. е. получение с помощью М. изображений на светочувствительных слоях, широко применяется в сочетании со всеми другими методами микроскопического исследования. Оптическая система М. при микрофото- и микрокиносъёмке требует некоторой перестройки — иной по сравнению с визуальным наблюдением фокусировки окуляра относительно изображения, даваемого объективом (подробнее об этом см. в ст. Микропроекция ). Многие современные М. имеют постоянные (вмонтированные) устройства для микрофотографии, которые позволяют осуществлять такую перестройку и проектировать изображения препаратов на фотопластинку или плёнку (а большинство М. может быть с этой целью оснащено дополнительными принадлежностями). Микрофотография незаменима при документировании исследований, при изучении объектов в невидимых для глаза УФ и ИК лучах (см. выше), а также объектов со слабой интенсивностью свечения. Микрокиносъёмка важна при исследовании процессов, развёртывающихся во времени (жизнедеятельности тканевых клеток и микроорганизмов, роста кристаллов, протекания простейших химических реакций и т. п.).
Основные узлы микроскопа. В большинстве типов М. (за исключением инвертированных, см. ниже) над предметным столиком, на котором закрепляют препарат, располагается устройство для крепления объективов, а под столиком устанавливается конденсор. Любой М. имеет тубус (трубку), в котором устанавливаются окуляры; обязательной принадлежностью М. являются также механизмы для грубой и точной фокусировки (осуществляемой путём изменения относительного положения препарата, объектива и окуляра). Все эти узлы крепятся на штативе или корпусе М.
Тип применяемого конденсора зависит от выбора метода наблюдения. Светлопольные конденсоры и конденсоры для наблюдения по методу фазового или интерференционного контраста представляют собой сильно отличающиеся одна от другой двух- или трёхлинзовые системы. У светлопольных конденсоров числовая апертура может достигать 1,4; в их состав входит апертурная ирисовая диафрагма , которая иногда может смещаться в сторону для получения косого освещения препарата. Фазово-контрастные конденсоры снабжены кольцевыми диафрагмами. Сложными системами из линз и зеркал являются темнопольные конденсоры. Отдельную группу составляют эпиконденсоры — необходимые при наблюдении по методу тёмного поля в отражённом свете системы кольцеобразных линз и зеркал, устанавливаемых вокруг объектива. В УФ микроскопии применяются специальные зеркально-линзовые и линзовые конденсоры, прозрачные для ультрафиолетовых лучей.
