2.4. Скорость репликации
Скорость репликации генома регулируется в основном частотой инициирующих событий. Так, у Е. соli скорость копирования в каждой репликативной вилке постоянна и равна примерно 1500пн в секунду: следовательно, полный геном длиной 4·106пн реплицируется примерно за 40 мин. Если хромосома реплицируется быстрее, это значит, что увеличивается частота актов инициации в той же самой точке начала репликации при прежней скорости копирования. Клетки Е. соli делятся каждые 20 мин; это означает, что репликация ДНК инициируется в хромосомах, еще не закончивших предыдущий раунд репликации. Скорость движения репликативной вилки в эукариотических клетках значительно меньше (10-100пн в секунду), но завершение репликации хромосомы в разумное время обеспечивается одновременной инициацией во множестве точек. Итак, скорость репликации хромосом контролируется числом и расположением точек начала репликации. Например, в ранних эмбрионах дрозофилы репликация отдельной хромосомы осуществляется каждые 3 мин, благодаря почти одновременной инициации событий в точках, отстоящих друг от друга на 7000-8000пн. В тоже время известно, что у дрозофилы в ходе раннего эмбрионального развития, как скорость репликации, так и размеры и число репликонов тканеспецифичны. В культуре же соматических клеток той же дрозофилы скорость удвоения хромосом значительно более медленная, так как репликация начинается в гораздо меньшем числе точек, находящихся друг от друга на расстоянии 40000пн, при этом продолжительность S-фазы составляет 600 мин. Следовательно, при фиксированной скорости синтеза ДНК множественная инициация повышает скорость процесса репликации в целом и таким образом уменьшает время, необходимое для удвоения всего набора хромосом. Данные о числе репликонов и скорости репликации приведены в табл.1.
Различия в продолжительности S-фазы найдены и у других организмов. Например, у тритона S-фаза длится 1 ч в ядрах бластулы и 200 ч в предмейотической S-фазе сперматоцитов. Вероятно, длительность S-фазы определяется не скоростью синтеза ДНК, а числом задействованных ориджинов репликации. В ДНК клеток нейрулы тритона они находятся на расстоянии около 40 мкм друг от друга, а в соматических клетках – около 100 мкм.
Таблица 1
Число и длина репликонов у разных организмов.
В соответствии с современными представлениями репликоны у эукариот распределены в геноме не случайно, они расположены группами (replicon foci). В этих группах, или фокусах, собираются ферменты репликации, которые удлиняют вилки репликации одновременно 10-100 соседних репликонов длиной примерно по 100тпн каждый. Репликация в них завершается за 45–60 мин. Кроме этого существуют очень длинные репликоны (более 1000тпн) – столь большие, что репликация в них продолжается по нескольку часов.
Активация ориджинов репликации происходит на протяжении всей S-фазы. Например, АRS1 S.cerevisiae активируется в ранней, а АRS501 – в поздней S-фазе. Большинство ориджинов активируется в середине S-фазы. Интересно отметить, что участки хромосом S.cerevisiae, реплицирующиеся в ранней или поздней S-фазе, располагаются мозаично, то есть перемешаны. У S.cerevisiae было обнаружено, что центральная область хромосомы IV реплицируется в ранней, а теломеры – в поздней S-фазе. Участок ДНК размером 67тпн, прилежащий к теломере на правом конце хромосомы V и содержащий АRS501, реплицируется в поздней S-фазе. По-видимому, поздняя репликация этого участка хромосомы является следствием его соседства с теломерой. Кроме того, известно, что в конце S-фазы реплицируются "молчащие" гены, например неэкспрессирующиеся в определенных типах клеток локусы НМL и НМR, которые локализованы в субтеломерных областях. Активно экспрессирующиеся гены, например локус МАТ, напротив, реплицируются в первой половине S-фазы.
Глава 3. Инициация репликации
Ориджины репликации являются местом, с которого начинает свое движение репликативная вилка. Но ДНК-полимеразы не могут начать процесс репликации без помощи других белков. Белки, участвующие в распознавании ориджина и спсобствующие привлечению к нему праймазы – РНК-полимеразы, синтезирующей праймер, «затравку» для синтеза ДНК – и ДНК-полимеразы, образуют комплекс инициации репликации.
3.1 Инициация репликации у E.coli
Инициация репликации в оriС в системе in vitro начинается с формирования комплекса, в состав которого входят шесть белков: DnaА, DnaВ, DnaС, НU, Girase и SSВ. Сначала с девятичленной последовательностью связывается мономер DnaА, затем 20–40 мономеров этого белка формируют большой агрегат. ДНК ориджина опоясывает его, и цепи ДНК разъединяются в области трех тринадцатичленных последовательностей. На следующем этапе димер DnaВ/DпаС присоединяется к комплексу oriС/DnaА, формируя агрегат размером около 480 кДа, соответствующий сфере с радиусом 6 нм. В результате формируется вилка репликации.
3.2. Инициация репликации у эукариот
Инициация репликации ДНК эукариот начинается с образования комплекса ориджина репликации и белка-инициатора репликации. Этот комплекс называется пострепликативным (роst.-RС). Он служит платформой для сборки структур более высокого порядка, которые переводят хроматин в состояние, компетентное для репликации. Последовательные стадии образования комплексов инициации репликации показаны на рис. 7.
Белком-инициатором репликации ДНК в клетках эукариот является ОRС (origin recognition complex), который впервые был описан у S.cerevisiae. Впоследствии ORC-подобные белки были обнаружены и изучены и у других представителей эукариот, а также у млекопитающих и человека. У всех эукариот ОRС образован шестью субъединицами – Огс1-Огсб (120-50 кДа). Для жизнедеятельности S. cerevisiae существенны все шесть субъединиц комплекса. Две разные группы субъединиц ОRС участвуют в распознавании последовательностей ориджина при его связывании с ориджином репликации. Огс1, Огс2 и Огс4 взаимодействуют с АСS, остальные три субъединицы распознают B1– подобные элементы. Возможно, что связь с нуклеотидными последовательностями В1 осуществляет только Огс5. ОRС специфически связывается с ДНК только в присутствии АТР и обладает АТР-азной активностью, которая регулируется координированным взаимодействием белка с АТР и элементами АRS. АТР связывается с субъединицей Огс1 и играет роль кофактора, необходимого для присоединения ОRС к ориджину. Специфическая последовательность ориджина, связавшегося с ОRС, ингибирует АТРазную активность Огс1, в то время как однонитевые участки ДНК, появляющиеся в S-фазе, ее снова активируют. При этом меняется конформация ОRС – с вытянутой (ехtended) на изогнутую (bеnt). Возможно, связывание и гидролиз АТР субъединицей Огс1 участвуют в контролировании функций ОRС в клеточном цикле.
У делящихся дрожжей S.ротbe белок Огс4 содержит в N-концевом домене так называемые «АТ-крючки», с помощью которых ОRС связывается с несколькими областями АRS1, богатыми АТ-последовательностями. У S.cerevisiae ORS присоединяется к ориджину в конце митоза, образуя пострепликативный комплекс (post-RС), и остается связанным с ним в последующих клеточных циклах. При этом post-RС существует в фазах S, G2 и М, а в фазе G1 входит в состав пререпликативного комплекса (рге-RС).
Пререпликативный комплекс формируется на основе post-RC, этот процесс начинается во всех ориджинах одновременно на границе фаз М и G1 и завершается в конце G1 в ориджинах, активирующихся первыми при переходе в S-фазу. В ориджинах, активирующихся позже в S-фазе, образование рге-RC завершается в соответствующий для каждого из них период S-фазы. В G1-фазе во время сборки рге-RС ОRС способен взаимодействовать с циклинзависимыми киназами (Сdks, cyclin-dependent kinases). Это взаимодействие является одним из механизмов, позволяющих клетке формировать рге-RC после митоза. Первыми к post-RC на границе фаз М/G1 присоединяются белок Сdс6 (cell division cycle protein) и семейство шести белков Мст 2–7 (minichromosome maintenance proteins). Белки Мст 2–7 являются наиболее известными среди семейства «поддерживающих мини-хромосомы» белков, впервые идентифицированных у S.сerevisiae при исследовании мутантов, не способных к поддержанию стабильности мини-хромосом.
Рис. 7. Схема инициации репликации у эукариот
Белки Сdс6 и Мст 2–7 описаны у многих представителей эукариот, включая млекопитающих. Недавно было показано, что в клетках S.ротbе и высших эукариот в ранней стадии формирования рге-RС участвует еще один белок – Cdt1 (cell division termination). Белки Мст 2–7 образуют гексамерный комплекс МСМ – ключевой компонент рге-RС. МСМ генерирует контрольный сигнал на нереплицированном хроматине для ингибирования преждевременного митоза в G1-фазе. Также он необходим для продвижения клетки по циклу в S-фазу. Присоединение МСМ к ориджину репликации регулируется фосфорилированием-дефосфорилированием отдельных субъединиц этого комплекса. Например, частичное дефосфорилирование Мст4-субъелиницы, гиперфосфорилированной в фазе М, способствует образованию рге-RС, а полное дефосфорилирование Мст3-субъединицы инактивирует комплекс и препятствует его связыванию с хроматином. В то же время, присоединение МСМ к ориджину зависит от белков Сdс6 и Сdt1, которые совместно «насаживают» МСМ на хроматин. В отсутствие Сdс6 клетки S.cerevisiae теряют способность инициировать репликацию ДНК и подвергаются «урезанному» митозу и нереплицированные хромосомы сегрегируют случайным образом к полюсам веретена.
