Способность Сdс6 предотвращать «урезанный» митоз до завершения репликации ДНК обеспечивается его взаимодействием с Cdks. Активность Сdс6 в фазе G1 регулируется также его взаимодействием с АТР, так как мутации в консервативных последовательностях АТР-связываюшего мотива Сdс6 приводили к потере способности хроматина присоединять МСМ в клетках S.cerevisiae и к подавлению репликации ДНК в клетках человека. У S.cerevisiae в присоединении МСМ к рге-RС принимает участие еще один белок – Mcm10, который ассоциирован с хроматином и взаимодействует с компонентами Мст2-7. Столь сложный кнтроль связывания МСМ с ориджином свидетельствует о том, что в клетке существует многоступенчатая система регуляторных механизмов, необходимая для недопущения повторного митоза при нереплицированном хроматине. Связывание МСМ с ориджинами репликации необходимо для обеспечения стабильности генома, именно оно переводит хроматин |в состояние, за которым закрепилось название «разрешающего» репликацию (replication-liscensing). У кеенопуса для связывания МCM требуется наличие дополнительного фактора, носящего такое же название, RLF-B (герlication licensing factor B). Белки МCM обнаруживают аффинность к гистонам, а не к ДНК, в результате чего в конце G1-фазы весь пререпликативный комплекс прочно привязывается к хроматину непосредственно в участке ориджина репликации или рядом с ним.
В G1-фазе к частично сформированному рге-RC присоединяется киназа Сdc7 со своей регуляторной субъединицей Dbf4 (DNA binding factor 4), а в поздней G1-фазе или на границе фаз G1/S – белок Сdс45 и связывающий однонитевую ДНК репликативный белок А (RРA, replication protein A). Взаимодействие между Сdс45 и Dbf4/Cdc7 в поздней G1-фазе требуется для последующего «включения» репликации в ориджинах после сборки рге-RС.
Киназа Dbf4/Cdc7 связывается с ori за некоторое время до того, как начинает выполнять свои функции. Присоединившись к рге-RС, киназа Dbf4/Cdc7 «ждет», когда активируются Сdk, и только после этого фосфорилирует свои субстраты. Роль «раннего» связывания этой киназы с ori пока остается неясной.
Связывание Сdс45 с хроматином зависит от белков Сdс6 и Мст2 и от активности киназы Dbf4/Cdc7 и циклинзависимых киназ S-фазы (Cdk-S-фазы – Сdс28/Сkb5,6 у дрожжей и Сdk2/Сусlins А,Е у высших эукариот). Белок Сdc45 может быть фосфорилирован киназой Dbf4/Cdc7, но это происходит только после активации Cdk-S-фазы. Активность Cdk-S в свою очередь регулируется ингибитором Sic1, который в конце фазы G1 подвергается убиквитинзависимому протеолизу. Присоединение белка Сdс45 к рге-RС происходит в поздней G1-фазе клеточного цикла только на ориджинах тех репликонов, которые начинают синтез ДНК первыми при переходе к S-фазе. Cdk-S и Dbf4/Cdc7-зависимое связывание Cdc45 с остальными ориджинами осуществляется в определенное для каждого из них время на протяжении всей S-фазы. Вероятный механизм присоединения Сdс45 к рге-RС таков: Dbf4/Cdc7, связавшаяся со всеми ориджинами репликации в фазе G1, после воздействия Cdk-S фосфорилирует Мст2 в каждом ориджине в тот период фазы S, который определяется индивидуально для каждого ориджина. В результате фосфорилирования Мст2 конформация комплекса МСМ меняется таким образом, что он приобретает способность связывать Сdс45. В то же самое время к рге-RС присоединяется белок RРА. Подобно Сdс45 RРА связывается с ориджином Cdk-S зависимым образом при участии Мст2. Присоединение белков Сdс45 и RРА завершает сборку рге-RС. Сразу после завершения сборки рге-RС происходит частичная его диссоциация, сопровождающаяся началом формирования RС (replication complex). Белок Сdc6 первым диссоциирует из рге-RС при переходе из фазы G1 в S или даже ранее, подвергаясь фосфорилированию под действием Сdks, за которым следуют убиквитинирование и деградация. Этот путь инактивации Сdс6 показан как для низших эукариот, так и для некоторых представителей высших эукариот. В клетках человека уровень Сdc6 остается постоянным на протяжении всего клеточного цикла. Но при переходе в S-фазу Сdс6 транспортируется из ядра в цитоплазму. По всей видимости, и этот процесс регулируется Сdks. Удаление Сdc6р из ядра (путем гидролиза или транспортировки в цитоплазму) является одним из механизмов, предотвращающих множественные акты репликации в течение одного клеточного цикла.
Белок Сdt1 также инактивируется после завершения формирования рге-RС. При этом в клетках низших эукариот Cdt1. периодически экспрессируется, накапливаясь в ядрах в фазе G1, а в фазе G2 его уровень падает. У высших эукариот активность Сdt1 контролируется белком-ингибитором геминином, который отсутствует в клетках в фазе G1, накапливается на протяжении фаз S, G2 и частично – фазы М и исчезает в М-фазе на границе метафазы и анафазы.
В отличие от Сdс6 и Сdt1 белки Мст2-7, RРА и Сdс45, диссоциировав из рге-RС, остаются связанными с хроматином в S-фазе во время синтеза ДНК. Быстрое освобождение МСМ из рте-RС в клетках дрожжей обеспечивается взаимодействием между Мcm10 и Мст7. Разъединению МСМ и Мст10 способствует белок Сdс45.
Субъединицы Мст4,6,7 комплекса МСМ обладают геликазной активностью, проявляющейся только при стимуляции под действием Cdk-S и киназы Dbf4/Cdc7. Белки Мст2-7 существенны не только для инициации, но и для элонгационной фазы репликации, для прогрессии репликативных вилок. МСМ входит в состав RС и принимает участие в раскручивании двунитевой ДНК в репликативных вилках. В клетках человека связывание МСМ с ориджином при формировании RС осуществляется с участием белка Мcm10, который накапливается и образует комплекс с хроматином в S-фазе, в отличие от Мcm10 S.сегevisiae. При переходе клеток из фазы G2 в М Мcm10 гиперфосфорилируется и диссоциирует из хроматина, а на границе фаз М/G1 он подвергается протеолизу по протеосомному механизму. Таким образом, фосфорилирование и протеолиз Мcm10 в клетках человека осуществляют отрицательную регуляцию активности МСМ после завершения репликации ДНК. Кроме того, отрицательная регуляция активности МСМ может быть результатом непосредственного фосфорилирования отдельных компонентов самого этого комплекса. Так, например, фосфорилирование Cdk специфических сайтов Мcm4 в фазе М приводит к потере геликазной активности Мст4,6,7, а высокая концентрация комплекса Cdk-циклин Е в ядрах эмбрионов Хепорus препятствует связыванию Мст3 с ДНК и таким образом предотвращает реассоциацию МСМ с хроматином после завершения репликации. Комплекс МСМ участвует не только в ранних этапах инициации репликации при переходе клеток в фазу G1, но и в завершении этого процесса в фазе S. Причем на завершающем этапе инициации репликации МСМ выполняет две функции: раскручивает ДНК в ориджине и служит остовом, к которому присоединяются остальные компоненты при формировании RС. Поэтому множественные механизмы регуляции активности МСМ вполне объяснимы. Если в фазе G1 эти механизмы направлены на осуществление продвижения клеток к фазе S без повторного митоза, то в фазах S и G2 они предотвращают повторную репликацию уже реплицированного хроматина.
RРА является белком, связывающим однонитевую ДНК и наличие его в RС при инициации репликации необходимо для стабилизирования расплетенного участка ДНК. RРА образован тремя субъединицами с молекулярными массами 70, 34 и 11 кДа, причем активностью, связывающей однонитевую ДНК, обладает субъединица 70 кДа, а субъединица 34 кДа является регуляторной. Последняя фосфорилируется Сdk, что, по-видимому, необходимо для активации репликации ДНК. Подробное описание этого комплекса будет дано далее.
Белок Сdс45 также участвует в формировании RС. Он необходим для присоединения ДНК-полимеразы α к ориджинам репликации. Показано, что белок Сdс45 человека связывается с белком Мст7 человека и субъединицей р70 ДНК-полимеразы α in vitro. Сdс45 присоединяет ДНК-полимеразу α к RС посредством связывания с Мст7. В клетках дрожжей S.cerevisiae Сdс45 присоединяет ДНК-полимеразу α к хроматину с участием Мст2.
Одним из компонентов комплекса, запускающего репликацию ДНК, является ДНК-полимераза α. Из всех многочисленных ДНК-полимераз эукариот именно она содержит праймазную активность, способную синтезировать короткую РНК «затравку» – праймер из рибонуклеозидтрифосфатов. РНК-праймер генерирует сигнал, который является одним из пусковых механизмов репликации. ДНК-полимераза α обнаружена у всех исследованных эукариот и хорошо изучена. Подробное описание этого фермента будет дано в следующем разделе. Показано, что один из путей регуляции инициации репликации связан с фосфорилированием двух больших субъединиц ДНК-полимеразы α под действием Сdk. При этом циклин Е и Сdk стимулируют инициацию репликации при переходе клетки в S-фазу, а циклин А и Сdk ингибируют ее в фазе G2.
Очевидно, что активация упоминавшихся выше «ранне– и позднеактивных» ориджинов S.cerevisiae зависит от киназы Dbf4/Сdс7р. Вероятно, в каждом ориджине происходит локальная регуляция его активности дополнительными протеинкиназами, например Rad53. Киназа Rad53 блокирует запуск "позднеактивных" ориджинов в ранней S-фазе. Когда это блокирование устраняется, киназа Dbf4/Сdс7р активирует МСМ, что приводит сразу к нескольким последствиям: стимуляции геликазной активности МСМ и связыванию белка RРА и ДНК-полимеразы α с ориджинами репликации. Присоединение ДНК-полимеразы α к RС, раскручивание ДНК в ориджине и синтез РНК-праймера завершают процесс инициации репликации ДНК эукариот. Следует отметить, что роль ДНК-полимеразы α ограничивается только запуском репликации ДНК. Эта ДНК-полимераза не способна к процессивному, то еть протяженному, синтезу ДНК и не обладает корректирующей активностью. Поэтому в дальнейшем в процессе репликации она добавляет к РНК-праймеру приблизительно 20 нуклеотидов и замещается ДНК-полимеразами δ или ε.
