Молодой человек отправился в 1763 году в Париж изучать медицину. После пятилетних занятий, главным образом под руководством Антуана Пти (по мнению Pagel Biograph Lexicon IV. P. 544, «одного из наиболее выдающихся практиков своего времени»), Гийотен получает степень доктора в Реймсе. Он вынужден был ехать в этот город, так как получение этой степени в Париже было сопряжено с весьма большими расходами (около 8 тысяч франков), а в денежных средствах он был стеснен. Незаурядные интеллектуальные способности помогли ему стать «факультетским стипендиатом». Стипендия эта, завещанная одним из членов Парижского медицинского факультета, выдавалась ежегодно после вступительного экзамена одному из способных студентов медиков. Стипендия давала так же право на бесплатную защиту всех ученых степеней, бывших в реестре факультета. 26 октября 1770 года Гийотен получил из рук Poissonier, члена Парижской академии, берет и плащ парижского доктора, дававший ему право врачебной практики в Париже.
Доктор Гийотен достиг высшей медицинской степени того времени, он стал «docteur regent» («доктор регент»). Благодаря этому он занял место профессора анатомии, физиологии и патологии при Парижском факультете. Как врач и преподаватель он вскоре стал пользоваться значительной известностью. Суждения Гийотена, как говорит Ларусс (Larousse), всегда были проницательны и мудры. Даже правительство неоднократно приглашало его высказать свое мнение по важным вопросам. Так, он отсоветовал правительству вводить налог на уксус; убедил принять меры по предупреждению опасности собачьего бешенства; предложил осуществить осушение болот Poitou и Saintonge, дабы застраховаться от эпидемии малярии.
Доктор Гийотен участвовал в комиссии, на которую была возложена обязанность научно исследовать вопрос о колдовстве, требовалось доказать сельскому населению его абсурдность. В середине XVIII столетия в университетском городе Вюрцбурге на основании экспертного заключения медицинского факультета была сожжена одна девушка, признанная колдуньей. Этот яркий факт показывает, что дикость и невежество отнюдь не прерогатива крестьян. В 1784 году Гийотен был включен в представительскую комиссию, которая исследовала целебную силу животного магнетизма Месмера, чудесные исцеления которого вызвали громадную сенсацию в Париже, особенно в придворных кругах.
Тяжелое экономическое положение Франции побудило Людовика XVI созвать в 1789 году Генеральные штаты, не собиравшиеся с 1614 года. Одновременно было предложено ученым и другим образованным людям высказаться по составу этого высшего сословно-представительского учреждения. Гийотен, не занимавшийся до этого политикой, изложил 8 декабря 1788 года свои взгляды в брошюре «Petition des citoyens domicilies a Paris», которая сразу сделала его героем дня. В ней «с удивительной яркостью и образцовой умеренностью» была представлена точка зрения третьего сословия. Историк Шассэн (Chassin) характеризует брошюру как «весьма замечательный политический и литературный труд, принадлежащий по времени и значению к первым символам веры, подготовившим великое революционное движение». От имени 3-го сословия Гийотен требует допустить к работе в Генеральных штатах столько же представителей третьего сословия, сколько предполагало участвовать представителей от дворянства и духовенства вместе взятых.
Официальные представители парижской буржуазии приняли брошюру Гийотена как свою политическую программу. Парламент наложил на нее запрет, и вскоре Гийотен был вызван для допроса. Он объяснил свои мотивы: «Мной руководили не личные интересы, а лишь патриотизм и забота об общественном благе». Говорят, он проявил в своей речи такую силу убеждения, что огромная толпа, присутствующая на заседании парламента, устроила ему на выходе овации, увенчала цветами и с триумфом проводила домой. Так начиналась его политическая карьера.
Доктор Гийотен был избран в Генеральные штаты представителем парижской буржуазии, в числе депутатов от Парижского округа. 5 мая 1789 года, в первый день заседания в Версале, Гийотен был избран инспектором зала заседаний. Должность была весьма престижной и ответственной на стадии организации работы штатов. В этом же году депутаты 3-го сословия Генеральных штатов объявили себя Национальным собранием.
По предложению Гийотена Национальное собрание учредило в 1790 году комиссию общественного здравоохранения. Будучи членом этой комиссии, он внес в собрание в 1791 году от имени комиссии проект реформы медицинского обслуживания населения и образования во Франции. Преподавание на медицинских факультетах было поставлено неудовлетворительно. Парижский факультет имел 7 кафедр (акушерство, патология, физиология, фармация, латинская и французская хирургия и material medica), но практические занятия на них были непопулярны; клинического преподавания не было почти никакого, так как факультет находился вне всякой связи с больницами. Первую клинику во Франции по внутренним болезням открыл в Париже Дебуа де Рошфор (Desbois de Rochefort) в 1795 году. В течение целого года в Париже для анатомирования пользовались лишь двумя трупами. Врачи, прошедшие обучение, не имели никакой практической подготовки и, как горько острил Декарт, получали необходимый опыт лишь после массового убийства своих пациентов.
В делах факультета было немало злоупотреблений: получение звания врача или докторской степени обходилось кандидату очень дорого. Стоимость была столь высока, что число врачей в Париже ежегодно увеличивалось не более чем на 6–7 человек. Например, в 1789 году на Парижском факультете числилось 148 docteurs regents, многие из которых жили не в самом Париже. Число студентов, изучающих медицину в Париже, было не более 60 человек. Дворянство жаловалось, что «невежество деревенских хирургов ежегодно уносит больше жизней граждан, чем десятки сражений». Это печальное положение вещей требовало немедленных реформ. Но их-то как раз и не было. Гийотен требовал прекратить покупать медицинские степени, организовать практическое преподавание акушерства, ввести шестилетний курс обучения в медицинских школах и госпиталях.
В 1803 году после многочисленных попыток законопроект о реформе медицинского образования и врачебного сословия наконец-то был принят. Однако закон был урезан и уступал более прогрессивным планам Гийотена. Лишь в 1891 году, спустя 100 лет после предложения Гийотена, реформа была проведена, причем она соответствовала в общих чертах его требованиям относительно организации преподавания и клинического обучения медицине.
После закрытия Национального собрания Гийотен примкнул к клубу фельянов, более умеренным членам якобинского клуба, который был основан в 1791 году; фельяны стремились к конституционной монархии. С закрытием в 1791 году Национального собрания закончилась в основном и политическая деятельность Гийотена.
Перейдем непосредственно к той стороне деятельности Гийотена, которая в силу рокового недоразумения создала ему одиозное имя. Исходя из благородного стремления уничтожить укоренившиеся в государстве злоупотребления и реализовать начала равенства перед законом, Гийотен выступил в знаменитом заседании 1 декабря 1789 года с декларацией прав человека, давшей повод к изобретению слова «гильотина». В то время обсуждался новый уголовный кодекс и вопросы исполнения наказаний. Гийотен выступил ярым защитником равенства наказаний для всех осужденных без различия ранга и состояния. При старом режиме дворянин пользовался исключительной привилегией, если его приговаривали к смерти, то обезглавливали. Казнь посредством обезглавливания считалась более благородной, чем колесование, виселица и т. п., предназначавшиеся для простых смертных и носившие обесчещивающий характер. Добавим, что колесование и повешение влекли за собой позор не только для осужденного, но и для всей его семьи, между тем как обезглавливание никак не отражалось на семье казненного дворянина. Принятый в 1789 году принцип равенства всех перед законом повлек за собою, естественно, и равенство перед наказанием, которое должно варьироваться сообразно преступлению, а не общественному положению осужденного.
10 октября 1789 года Гийотен предложил Национальному собранию установить равенство казней для всех, а равно укорачивать страдания осужденного. Первого декабря он защищал свои предложения, и они были приняты с большим энтузиазмом. Национальное собрание вотировало следующие 4 статьи, предложенные Гийотеном: 1) об установлении однообразного способа казни, независимо от принадлежности осужденного к тому или другому сословию; 2) о запрещении конфискации имущества казненных; 3) о выдаче семье тела казненного для погребения; 4) о запрещении упоминать в метрическом свидетельстве о казни, так как провозглашен принцип, что на семью не должен ложиться позор. Помимо этих предложений Гийотен, исходя из принципов гуманности, особенно настаивал на необходимости избавлять осужденного от медлительности, нерешительности и неловкости палачей; он предложил производить обезглавливание машиной. Во время прений Гийотен, отвечая на возражения, неосторожно воскликнул: «При помощи моей машины я в одно мгновение отрублю вам голову без малейших страданий с вашей стороны». Неосторожное выражение, за которым последовал взрыв смеха, оказалось роковым для имени Гийотена.