Эмбриоидные тела
Мечта о выращивании эмбрионоподобных структур в лабораторных условиях не нова. Можно выделить разные ключевые этапы, но, на мой взгляд, серьезный прорыв в создании живых моделей эмбрионального развития был получен благодаря наблюдениям, сделанным в лаборатории Джексона в Бар-Харборе, штат Мэн, которые предоставили первые сведения о «бодибилдерском» потенциале ЭС-клеток. Там в 1950-х Лерой Стивенс обнаружил линию мышей, страдающих спонтанным образованием тестикулярных тератом (тератокарцином) — опухолей, состоящих из смеси эмбриональных и взрослых тканей [2]. Когда Стивенс и его коллега Дон Варнам пересадили образцы тератом в брюшную полость мышей, у тех сформировались целые агрегаты клеток. Несмотря на то что их рост носил бессистемный характер, Стивенс увидел в них некоторое сходство с мышиными эмбрионами в возрасте нескольких дней [3]. Эти структуры, построенные из ЭС-клеток, были названы эмбриоидными телами.
Поскольку такие опухоли состоят из клеток различных тканей, предполагалось, что они вырастают не из зрелых, а из недифференцированных мультипотентных клеток, имеющих близкое сходство с эмбриональными. Их стали называть клетками эмбриональных карцином (ЭК) [4].
На данном этапе ключевую роль сыграл Мартин Эванс. После серии экспериментов в 1970-х, в том числе вместе с Ричардом Гарднером, Мартин показал, что дифференциация этих клеток была вовсе не аномальной (как у злокачественных клеток), а похожей на таковую в эмбрионе. Хотя это означало, что можно изолировать клетки из раннего эмбриона и позволить им расти в лабораторных условиях, на совершение этого подвига потребовалось еще пять лет [5]. В 1980 году Мартин объединился с эмбриологом Мэттом Кауфманом и на следующий год представил в Nature доклад об открытии ЭК-подобных клеток, которые способны вызывать тератомы, а также использоваться для создания химер, продуцирующих функциональные зародышевые клетки; сегодня они известны как ЭС-клетки [6]. В том же году Гейл Мартин из Калифорнийского университета в Сан-Франциско умудрился вырастить ЭК-клетки из эмбриона [7].
В своей фундаментальной статье, опубликованной в Nature, Мартин подчеркнул, что ЭС-клетки можно использовать для генной модификации, а в 1986 году сделал вывод, что эти клетки являются эффективным средством для создания генетически измененных, или трансгенных животных. За это открытие он получил Нобелевскую премию 2007 года. Учитывая пластичность этих клеток для построения всех остальных типов клеток или эмбриональных тканей, кроме внеэмбриональных, казалось разумным предположить, что при выращивании ЭС-клеток в культуре можно воспроизвести развитие эмбриона. Не совсем так. ЭС-клетки способны сформировать эмбриоидные тела, но эти тела не выглядят и не развиваются как эмбрион.
Хотя я много знаю об ЭС-клетках (разумеется, от Мартина), я вдохновилась эмбриоидными телами гораздо позже, благодаря случайной встрече. Когда Саймону было около двух месяцев, мы с Дэвидом взяли его и Наташу в Японию на Окинаву, где Дэвид должен был выступать на конференции. По пути нам пришлось заглянуть в Стэнфордский университет, куда меня пригласил прочитать лекцию мой друг Мэтт Скотт, выдающийся профессор биологии развития, генетик и биоинженер. Во время этого визита я познакомилась с Роэлем Нуссе и его коллегой Дерком тен Бергом, которые любезно поделились со мной своим недавним открытием, связанным с эмбриоидными телами, — они знали, что я отслеживаю процесс создания и нарушения симметрии в эмбрионе. Они выяснили, что эмбриоидные тела могут спонтанно нарушать свою симметрию, в результате чего инициируются паттерны и активируются гены, такие как Brachyury, необходимые для создания мезодермы [8].
Это было потрясающее наблюдение. Тогда я и подумать не могла, что однажды попытаюсь создать эмбрионоподобные структуры, чтобы понять механизмы нарушения симметрии. Лишь годы спустя, вдохновленная нашими результатами, показавшими трансформацию плюрипотентных, неполярных клеток в высокополяризованную розетку на стадии имплантации, я поняла, что мы можем воссоздать этот процесс с помощью ЭС-клеток и построить эмбрионоподобную структуру в нашей лаборатории. Однако мы применили совершенно иной подход.
(window.adrunTag = window.adrunTag || []).push({v: 1, el: 'adrun-4-390', c: 4, b: 390})
Как сделать эмбрион
Когда мы наконец-то нашли способ культивирования эмбрионов на стадии имплантации и начали изучать подробности их роста и самоорганизации, мы обнаружили, что это зависит не только от количества клеток, но и от контекста. Под контекстом я подразумеваю хореографию каждого типа клеток и их взаимодействие друг с другом в критическую фазу развития, когда эмбрион впервые увеличивается в размерах и претерпевает метаморфозы. Из работ многих великих биологов, занимавшихся онтогенезом млекопитающих, мы знали, что взаимодействие конкретных клеточных типов имеет решающее значение для нормального развития эмбриона, но точные взаимосвязи и пути, задействованные на этой специфической стадии онтогенеза, оставались для нас загадкой. Культивируя эмбрионы на стадии имплантации in vitro, мы научились распознавать химические и механические сигналы, побуждающие аморфный эпибласт превратиться в розетку из поляризованных клеток. Мы обнаружили, что эта самоорганизация запускается сигналом, в котором участвует внеклеточный матрикс, предоставляемый экстраэмбриональной примитивной энтодермой, и белок бета-интегрин, лежащий на поверхности клеток эпибласта [9]. И мы задались вопросом о том, можно ли сымитировать начало этого процесса у стволовых клеток, если предоставить им правильный контекст.
Наш первый подход был очень простым. Мы взяли клетки только одного типа (ЭС-клетки) и поместили их в трехмерный каркас — гелевую субстанцию матригель, которая содержит материал, в норме предоставляемый примитивной энтодермой. Мы подумали, что это индуцирует поляризацию клеток, которой может оказаться достаточно для запуска клеточной самоорганизации.
Коллега из моей команды, Иван Беджов, занимавшийся этим проектом, увидел, что через тридцать шесть часов культивирования пролиферирующая группа ЭС-клеток и впрямь самоорганизовалась в трехмерную розеткообразную структуру из поляризованных клеток. Эта розетка выглядела точно так же, как та, которую мы наблюдали во время имплантации эмбриона. Затем розетка «эволюционировала» и образовала полость — люмен. Опять же, словно эмбрион, открывающий свою амниотическую полость.
Так мы осознали, что с помощью одних лишь ЭС-клеток можем имитировать первые этапы эмбрионального развития. Несмотря на то что мы использовали только один из трех базовых типов стволовых клеток, присутствующих на заре жизни, нам удалось компенсировать (как минимум частично) отсутствие остальных двух типов подбором правильного количества клеток и правильного окружения из химических соединений, позволяющих клеткам самоорганизовываться.
С помощью нашей первой модели развивающегося эмбриона Иван попытался разобраться в молекулярных сигналах, запускающих формирование проамниотической полости. Когда он использовал ЭС-клетки, лишенные бета-интегрина, они не смогли образовать полость, что указывало на критическую важность передачи сигнала (посредством этого белка) между внеэмбриональными и эмбриональными тканями. Это наглядная демонстрация пользы упрощенных моделей эмбрионов для изучения эмбриогенеза. Наше открытие розетки, механизмов ее формирования в эмбрионе, а также ее имитация при помощи ЭС-клеток были опубликованы в 2014 году в журнале Cell [10].
Но можно ли было воспроизвести следующий шаг развития, тот, что приводит к нарушению симметрии и гаструляции, существенной для формирования всех тканей эмбриона? Те, кто занимается биологией развития, легко ответят на этот вопрос. Вместо использования одних только ЭС-клеток следовало добавить стволовые клетки, формирующие трофэктодерму, из которой образуется плацента, а также стволовые клетки, формирующие примитивную энтодерму, из которой получается желточный мешок. Могли этот рецепт привести к самоорганизации целого эмбриона, ведущей, в свою очередь, к нарушению симметрии?
