Между гетманом и Кочубеем существовала семейная вражда. У Кочубея было две дочери: одна - Анна, вышедшая за Мазепина племянника Обидовского и скоро овдовевшая, другая - Матрена, Мазепина крестница. Мазепа, будучи вдовцом, вздумал сделать предложение Матрене. Родители воспротивились такому браку, который ни в каком случае не мог быть дозволительным по церковным правилам. Мать Матрены, женщина гордая и вздорная, начала после того обращаться сурово со своей дочерью и довела ее до того, что ей не стало терпения жить в родительском доме, находившемся в Батурине, где ее отец должен был постоянно проживать по званию генерального судьи. Матрена убежала к гетману. Мазепа, не желая срамить девушку, отослал ее обратно к родителям, хотя писал ей потом: "Никого еще на свете я так не любил, как вас, и для меня было бы счастье и радость, если бы вы приехали и жили бы у меня, но я сообразил, какой конец из того может выйти, особенно при такой злобе и ехидстве ваших родных: пришло бы от церкви неблагословение, чтоб вместе не жить, и где бы я тогда вас дел. Мне вас было жаль, чтоб вы потом на меня не плакали". Но положение возвращенной в родительский дом Матрены стало еще хуже: мать мучила ее жестоким обращением; отец, находясь под сильным влиянием жены, поступал во всем так, как она хотела. Родители Матрены жаловались в кругу своих знакомых, что гетман обольстил их дочь и обесславил их семью. Матрена тайно переписывалась с Мазепой, жаловалась на мать, называя ее мучительницей. Мазепа утешал ее, уверял в своей любви, но советовал ей в крайнем случае идти в монастырь. Кочубей писал к Мазепе упреки, а Мазепа отвечал ему: "Ты упоминаешь о каком-то блуде; я не знаю и не понимаю ничего; сам ты, видно, блудишь, слушаясь своей гордой, болтливой жены, которую, как вижу, не умеешь сдерживать. Справедлива народная пословица: где всем правит хвост, там, наверно, голова блудит. Жена твоя, а не кто другой причиной твоей домашней печали. Святая Варвара убегала от своего отца, да и не в гетманский дом, а к пастухам в каменные расщелины".
По наущению жены своей, Кочубей искал возможности тем или другим способом сделать гетману зло и пришел к мысли: составить донос и обвинить гетмана в измене. Сначала посредником для представления доноса выбран был какой-то великорусский монах из Севска, шатавшийся за милостыней по Малороссии. Он был принят у Кочубея в Батурине, накормлен, одарен, и выслушал от Кочубея и от его жены жалобный рассказ о том, как гетман, зазвавши к себе в гости дочь Кочубея, свою крестницу, изнасиловал ее. Когда этот монах посетил Кочубеев в другой раз, супруги сперва заставили монаха целовать крест в том, что будет хранить в тайне то, что услышит от них, потом Кочубей сказал: "Гетман хочет отложиться от Москвы и пристать к ляхам; ступай в Москву и донеси об этом боярину Мусину-Пушкину". Монах исполнил поручение. Монаха допросили в Преображенском приказе, но никакого дела об измене малороссийского гетмана не начинали. Прошло несколько месяцев. Кочубеи, видя, что попытка не удалась, стали искать других путей; они согласились с бывшим полтавским полковником Искрой, свояком Кочубея. Не решаясь сам начинать дело, Искра услужил Кочубею только тем, что отправил полтавского попа Спасской церкви, Ивана Святайла, к своему приятелю, ахтырскому полковнику Федору Осипову, просить у него свидания по важному государеву делу. Ахтырский полковник съехался с Искрой в своей пасеке. "Я слышал от Кочубея, - сказал ему Искра, - что Мазепа, соединившись с Лещинским, намерен изменить царю и даже злоумышлял на жизнь государя, думая, что государь приедет к нему в Батурин".
Ахтырский полковник известил о слышанном киевского воеводу и в то же время отправил в Москву от себя письма о предполагаемой измене гетмана, между прочим письмо к царевичу Алексею. Царь узнал обо всем 10 марта 1708 года и в собственноручном письме к Мазепе обо всем известил гетмана, сам уверял, что ничему не верит, считает все слышанное произведением неприятельской интриги, и заподозревал миргородского полковника Апостола, который, как царю было ведомо, недружелюбно относился к гетману. Царь заранее предоставлял гетману схватить и сковать своих недоброжелателей. Между тем сам Кочубей, по совету попа Святайла, отправил в Москву к царевичу еще один донос с перекрестом Янценком. Привезенный этим посланцем донос, доставлен был в руки государя. Но и этому доносу Петр не поверил и снова известил гетмана. Тогда гетман просил царя через канцлера Головкина повелеть взять доносчиков и прислать в Киев, чтоб судить их в глазах малороссийского народа. Царь на это согласился. Кочубей находился в своем имении Диканьке, близ Полтавы. Гетман отправил туда казаков взять его и Искру. Но Кочубей и Искра узнали об этом заранее, убежали в Ахтырский полк и спрятались в местечке Красный Кут под защиту ахтырского полковника. Гетман известил об этом канцлера Головкина, а Головкин отправил капитана Дубянского отыскать Кочубея, Искру и Осипова, благодарить их от имени государя за верность и пригласить их, для объяснения, ехать в Смоленск, надеясь на царскую милость и награждение. В то же время Петр, отпуская к Мазепе его генерального есаула Скоропадского, обнадеживал гетмана, что доносчикам, как клеветникам, не будет оказано никакого доверия и они примут достойную казнь.
Доносчики доверились Головкину и поехали. С Кочубеем и Искрой отправились ахтырский полковник Федор Осипов, поп Святайло, сотник Петр Кованько, племянник Искры, двое писарей и восемь слуг Кочубея и Искры. С Белгорода их сопровождал сильный конвой, но так, чтобы им не казалось, что они едут под караулом. 18 апреля 1708 года прибыли они в Витебск, где находилась главная квартира государя.
На другой день после прибытия доносчиков, начали допрашивать их царские министры. Прежде всех спрашивали ахтырского полковника Осипова. Он был только передатчик того, что сообщили ему, и не мог сказать ничего важного и нового по самому делу. Затем, приступили к Кочубею, и тот подал на письме 33 статьи 1 доноса о разных признаках, обличавших, как думал доноситель, гетмана Мазепу в измене:
1) В 1706 году в Минске говорил ему гетман наедине, что княгиня Дольская, мать Вишневецких, родственница Станислава Лещинского, уверяла его, что король Станислав желает сделать Мазепу князем черниговским и даровать запорожскому войску желанную волю.
2) В том же году Мазепа дурно отзывался о гетмане польном литовском Огинском, который держался стороны русского государя.
3) Услыхавши, что король Август, оставив Польшу, уехал в Саксонию к шведскому королю, Мазепа сказал: "Вот чего боялись, того не убоялись".
4) В 1707 году, услыхавши, что у Пропойска побиты царские ратные люди, встретившись на дороге с Кочубеем, гетман спрашивал у него "тихим гласом": справедлива ли эта ведомость?
5) В том же году у себя в Батурине, за обедом, сказавши, что получил ведомость о поражении царских людей, смеялся и говорил: "Судья плачет об этом, но у него слезы текут (!)", а потом пил за здоровье княгини Дольской.
6) Через неделю после того гетман объявлял Кочубею, что от достоверных людей слыхал, будто король шведский хочет идти на Москву и учинить там иного царя, а на Киев пойдет король Станислав; Мазепа сказал при этом: "Я просил у государя войска оборонять Киев и Украину, а он отказал, и нам придется поневоле пристать к королю Станиславу".
7) 17 мая того же года я просил дозволения отдать свою дочь за сына Чуйкевича и в следующее воскресенье устроить сватовство, а Мазепа сказал: "Как будем с ляхами в соединении, тогда для твоей дочери найдется жених знатный шляхтич, потому что хотя бы мы добровольно ляхам не покорились, то они нас завоюют". И мы с Чуйкевичем на другой после того день порешили обвенчать наших детей поскорее.
8) 28 мая сербский епископ Рувим говорил, что гетман печалился и жаловался, что государь обременяет его требованием доставки лошадей.
9) 29 мая гетман пригласил недавно обвенчанную дочь мою в Гончаровку крестить с ним девочку жидовку и за обедом сказал ей: "Москва хочет взять в крепкую работу всю малороссийскую Украину".
10) Один канцелярист писал записку, что в Киеве иезуит ксендз Заленский говорил ему и другим: "Вы, господа казаки, не бойтесь шведов, которые не на вас готовятся, а на Москву. Никто не знает, где огонь кроется и тлеет, а все узнают тогда, когда вспыхнет пожар: только тот пожар не скоро угаснет". Мазепа в Киеве веселился, гулял с музыкой, вместе с полковниками, и всех заохочивал к веселости, а на другой день послан был казак с гетманскими письмами ко ксендзу Заленскому. С какой бы стати ему сноситься письменно с этим ксендзом, если бы у него не было злого намерения?
11) Писарь полтавский говорил своему племяннику, что в Печерском монастыре он приходил к гетману, а у гетмана были заперты двери, и гетманский служитель сказал: "Гетман с полковниками читает гадяцкий договор гетмана с поляками".
