Рис. 2. Виды повреждений ДНК и их репарации.
Повреждения ДНК, как правило, быстро устраняются ферментами репарации, которые исправляют разрывы нити ДНК, удаляют ошибки и заполняют возникшие пробелы в последовательности нуклеотидов[48], используя в качестве матрицы соответствующий участок второй цепочки молекулы ДНК. Однако с возрастом способность к репарации ухудшается. Угасание активности ферментов репарации ДНК является неплохим маркером старения клеток. На это есть несколько причин. Репарация – энергозатратный процесс, она требует большого количества молекулы АТФ («энергетической валюты» клетки), а ее выработка с возрастом снижается из-за дисфункции митохондрий, «энергетических станций» клетки. Упадок биосинтетических процессов приводит к нехватке дезоксинуклеозидов – букв генетического кода, а репарация возможна только при их наличии. Наконец, эпигенетические изменения[49] подавляют активность генов самих репарационных белков. Неустранимые повреждения в ДНК служат причиной мутаций – однобуквенных замен в генетических последовательностях либо удвоений (дупликаций) и выпадений целых участков (делеций) или поломок хромосом (аберраций). Нередко случаются и перемещения генетического материала с одного места на другое – транслокации и транспозиции, вызывающие генетическую нестабильность[50]. Мутации и аберрации являются одной из причин возрастного нарушения функции клетки, гибели клеток или их опухолевого перерождения.
Уровень накопления клетками повреждений, мутаций и хромосомных аберраций служит эффективным маркером скорости старения. Существуют различные лабораторные методы, позволяющие оценить состояние клеток организма (рис. 3).
Рис. 3. Методы оценки количества повреждений ДНК.
Микроядра – патологические структуры внутри клеток, как правило, возникающие вокруг отставших во время деления обломков хромосом. Они выявляются при специальном окрашивании клеток и их анализе под световым микроскопом. С возрастом количество клеток, имеющих микроядра, становится больше, например, среди лейкоцитов[51] крови или клеток кожи. Чем быстрее стареет организм, тем в более раннем возрасте наблюдается увеличение количества таких клеток.
Исследование с помощью люминесцентного микроскопа[52] светящихся (флуоресцентных) ДНК-зондов[53], имеющих сродство к тем или иным участкам хромосом человека, позволяет выявлять тонкие перестройки (транслокации, делеции, дупликации) в каждой из 46 хромосом человеческой клетки. Этот метод получил название FISH-окрашивания хромосом.
Еще один маркер старения – двухцепочечные разрывы ДНК, как правило, вызывающие фатальные для клетки повреждения либо ведущие к генетической нестабильности и опухолевому перерождению. Однако именно их с возрастом становится все больше и больше. Специальное гистохимическое окрашивание (так называемые фокусы гамма-H2AX и 53BP1) позволяет подсчитать под люминесцентным микроскопом число таких разрывов на ядро и тем самым оценить скорость старения изучаемой ткани (в молодых клетках обычно нет таких разрывов, хотя они могут появиться при действии на организм ионизирующей радиации).
При наличии повреждений молекула ДНК становится более подвижной в электрическом поле. Круглое ядро клетки с поврежденной ДНК при электрофорезе[54] становится вытянутым, а мелкие фракции разорванной ДНК формируют при этом «хвост кометы». Чем более выражен хвост, тем более повреждена клеточная ДНК. Данный метод имеет различные модификации, позволяющие полуколичественно (не поштучно, но с помощью конкретного числового показателя) учитывать разные типы повреждений – одно– и двухцепочечные разрывы ДНК, различные окисленные основания ДНК. Наши исследования, проведенные на клетках периферической крови, бравшейся прижизненно у мышей разного возраста, доказали возможность применения данного подхода для оценки интенсивности старения организма. Таким образом, устойчивость к повреждению, как и стрессоустойчивость в целом, в результате старения падает.
Выделенные из крови человека лимфоциты можно культивировать в лаборатории. Показатели гибели клеток, индуцированной повреждением ДНК или иммунной активацией, являются отличными маркерами скорости старения данного человека.
Собственно, мутации[55] позволяет выявлять метод секвенирования ДНК – побуквенного прочтения закодированной генетической информации. Накопление с возрастом одно– или многобуквенных изменений последовательности ДНК в жизненно важных генах – фактор старения или озлокачествления клетки.
С каждым делением клетки хромосомы укорачиваются с обоих концов. Концы хромосом защищены особыми «заглушками» – теломерами. Однако, когда теломеры укорачиваются и утрачиваются при многократном копировании ДНК, хромосомы начинают сливаться друг с другом, разрываться и индуцировать ответ клетки на повреждение, заканчивающийся выходом клетки из цикла делений или гибелью клетки. Как показали исследования под руководством нобелевского лауреата Э. Блекберн, длина теломер некоторых клеток крови (лимфоцитов) – надежный показатель скорости старения. Многолетние измерения показали, что люди с более короткими теломерами отличаются более высокими темпами старения, повышенной вероятностью сердечно-сосудистых проблем, рака и возрастзависимой макулярной дегенерации (форма старческой слепоты). Укорочению теломер способствует высокий уровень стрессовых гормонов (кортизола, адреналина, норадреналина) и курение.
В некоторых клетках тела функционирует особый фермент – теломераза, достраивающий теломеры. В норме он позволяет предшественникам половых клеток и стволовым[56] (а также раковым) клеткам делиться бесконечно. Количество теломеразы можно оценивать в лейкоцитах или стволовых клетках и тем самым предсказывать скорость старения. Измерение количества теломеразы в клетках крови, имеющих ядра (у эритроцитов, например, ядер нет), позволяет предсказывать не только состояние ускоренного старения, но и вероятность смерти от сердечно-сосудистых патологий.
Как показала группа Х. Джианг, дисфункция теломер и повреждение ДНК с возрастом отражаются на уровне определенных стресс-белков в плазме крови (CRAMP[57], статмина[58], EF-1α[59], хитиназы[60]). Данные изменения, помимо старения, проявляются при миелодиспластическом синдроме[61], IgA-нефропатии[62] и циррозе печени[63].
Повреждение ДНК вызывает в клетках каскад процессов, в результате которых клетки полностью утрачивают способность к делению. Это происходит из-за активации некоторых генов, таких как p16, блокирующих цикл клеточного деления. Изначально это явление возникло для предотвращения размножения предраковых клеток, однако теперь оно играет существенную роль в процессах старения человека. Как было показано, уровень активности гена p16 нарастает в иммунных Т-клетках периферической крови с возрастом, причем данный процесс протекает более интенсивно у курильщиков, что свидетельствует об их ускоренном старении.
На субклеточном уровне при старении также наблюдаются стойкие изменения. Живая клетка состоит из двух главных составляющих – ядра и цитоплазмы. В ядре клетки сосредоточен хроматин – наследственный материал, состоящий из ДНК и связанных с ней белков. Ядро выполняет функцию хранения и защиты по отношению к ДНК, а его оболочка служит своеобразным ситом, избирательно пропускающим макромолекулы из цитоплазмы в ядро и обратно. Таким образом, его значение в жизнедеятельности клетки трудно переоценить. Оболочка клеточного ядра подстилается каркасом из особых белков – ламинов. Поскольку ламины помогают концам хромосом заякориться в оболочке ядра и участвуют в правильной упаковке хроматина, то нарушение соотношений ламинов ведет к дестабилизации наследственного материала или гибели клеток. Дети с дефектом гена ламина А (синдром Хатчинсона – Гилфорда) к 12 годам приобретают все признаки глубокой старости. Изменение соотношения различных вариантов ламинов при обычном старении сопровождается отклонением формы ядер от нормы. Ядра вместо ровной округлой формы могут приобретать выпуклости или пузырьки на своей поверхности. Данные изменения можно наблюдать под световым микроскопом и таким образом учитывать долю старых клеток в образце. Окрашивание клетки при помощи антител[64] к ламинам A/C позволяет рассмотреть и подсчитать необычные ядра под люминесцентным микроскопом.
