В ноябре 2000 г. Совет глобального экологического фонда принял «Первоначальную стратегию помощи странам в подготовке к вступлению в силу Картахенского протокола по биобезопасности» и утвердил совместный с Программой ООН по охране окружающей среды (ЮНЕП) глобальный проект «Разработка национальных систем биобезопасности», имеющий целью оказание финансовой и технической помощи 100 странам в разработке и создании их национальных систем биобезопасности, содействие региональному и субрегиональному сотрудничеству и обмену опытом по этим проблемам, что в целом должно помочь странам при вступлении в силу Картахенского протокола. Беларусь вошла в список этих стран, и в 2003–2004 гг. был выполнен совместный проект правительства нашей страны и ЮНЕП «Разработка национальной системы биобезопасности для Республики Беларусь».
Существует много определений генетической инженерии. По мнению авторов, суть новой технологии можно выразить следующим образом. Генетическая инженерия — это технология получения новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса, созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в данном организме и у его потомства.
Генно-инженерный (трансгенный) организм – живой организм, содержащий новую комбинацию генетического материала, полученную с помощью генетической инженерии. Как видно из этого определения, процесс создания генно-инженерного (трансгенного) организма можно разделить на несколько этапов. Первый этап включает выделение и идентификацию отдельных генов (соответствующих фрагментов ДНК или РНК), которые собираются перенести другим организмам, а также соответствующих регуляторных элементов (без них никакой ген функционировать не будет). Иногда гены или их части синтезируют искусственно.
Затем эти гены и регуляторные элементы соединяют между собой в определенном порядке с помощью чисто химических методов (технология рекомбинантных ДНК, или генная инженерия). То есть все названные манипуляции проводят вне организма, in vitro. В результате получается генетическая конструкция, которая содержит один или несколько генов (точнее, фрагментов ДНК, кодирующих последовательность аминокислот протеинов – продуктов генов), а также все необходимые регуляторные элементы, обеспечивающие активность этих генов (трансгенов) после их переноса в организмы. Такие генетические конструкции далее соединяют с ДНК так называемого вектора для клонирования. В качестве вектора чаще всего используют плазмиды – небольшие кольцевые молекулы ДНК, имеющиеся у большинства бактерий. Создание конструкции «клонирующий вектор – встроенная ДНК» необходимо для эффективного переноса и активности трансгенов (репликации и трансляции) в живых организмах.
Следующий этап – перенос трансгенов в отдельные живые клетки (процесс трансформации, или, как принято его называть в последнее время, «генетической модификации»), где они могут реплицироваться и передаваться дочерним клеткам, образовавшимся при делении трансформированных клеток. В случае если все описанные процедуры прошли нормально, из одной трансформированной клетки при культивировании возникает множество клеток, которые содержат привнесенную искусственную генетическую конструкцию, и при этом образуются протеины – продукты трансгенов. Биосинтез новых для организма протеинов является основой для проявления у него нового селекционного признака, например толерантности к гербицидам, антибиотикам, устойчивости к насекомым-вредителям и т. д.
Для одноклеточных организмов процесс генетической модификации заканчивается, как правило, внедрением в них рекомбинантной плазмиды и последующим отбором трансформированных клеток. Лишь в отдельных случаях для более высокой стабильности трансформантов добиваются включения трансгенов в бактериальную хромосому. В случае же высших многоклеточных организмов встраивание трансгенов в генетический материал клетки (ДНК хромосом или клеточных органелл – хлоропластов, митохондрий) является обязательным. Более того, необходимо из одной или нескольких трансформированных клеток восстановить целый организм. А это весьма непростая задача, которая была решена (правда, не для всех видов организмов в полной мере) сравнительно недавно. В частности, первые растения, регенерированные из отдельных клеток, были получены в начале 60-х гг. прошлого века, что стало возможным благодаря разработке эффективных методов культивирования изолированных растительных клеток на специальных питательных средах. Добавка в питательные среды определенных регуляторов роста (фитогормонов) позволяет управлять процессами деления клеток в культуре in vitro, а также, что самое главное, индуцировать у них морфогенез, т. е. «заставлять» их образовывать отдельные органы (стебли, корни) или даже целые зародыши (процесс эмбриогенеза), из которых в дальнейшем можно получить целое растение.
Как видно из приведенного выше, технология получения генно-инженерных организмов позволяет значительно расширить возможности традиционной селекции. Более того, благодаря ей, можно получать такие организмы, которые в принципе невозможно получить с помощью обычной селекции. Она делает реальным решение проблем борьбы с болезнями, голодом, которые считались ранее практически неразрешимыми.
Исторически ситуация сложилась так, что первые генно-инженерные работы были проведены на микроорганизмах. Это вполне объяснимо: микроорганизмы, как правило, одноклеточные существа, имеющие относительно простую организацию аппарата наследственности. Генетические манипуляции, в том числе с помощью технологии рекомбинантных ДНК, на них производить значительно проще, чем на многоклеточных организмах. Поэтому именно с генно-инженерными микроорганизмами связаны первые выдающиеся достижения современной биотехнологии и, прежде всего, получение жизненно важных для людей веществ. Люди «научили» микробов производить совершенно несвойственные для них соединения, которые намного качественнее и дешевле «натуральных» аналогов. Наибольшее значение среди таких соединений имеют те, недостаток или отсутствие которых в человеческом организме приводит к серьезным заболеваниям: диабету, гемофилии, карликовости, анемии и др.
6.2. Генно-инженерные (трансгенные) организмы на службе у медицины
В настоящее время в мире, по данным Всемирной организации здравоохранения, насчитывается около 110 млн людей, страдающих диабетом. И эта цифра в ближайшие 25 лет может удвоиться. Диабет – тяжелое заболевание, которое вызывается нарушением работы поджелудочной железы, вырабатывающей гормон инсулин, необходимый для нормальной утилизации содержащихся в пище углеводов. На начальных стадиях развития болезни достаточно использовать меры профилактики, регулярно следить за уровнем сахара в крови, просто потреблять меньше сладкого. Однако приблизительно для 10 млн пациентов показана инсулиновая терапия: они вынуждены ежедневно вводить в кровь препараты этого гормона. Начиная с 20-х гг. прошлого века, для этих целей использовали инсулин, выделенный из поджелудочных желез свиней и телят. Животный инсулин в значительной степени аналогичен человеческому, однако между ними имеются и определенные отличия. Так, в молекуле инсулина свиньи в противовес человеческому в одной из цепей аминокислота треонин замещена аланином. Считается, что эти небольшие различия могут вызывать у отдельных пациентов серьезные осложнения (нарушение работы почек, расстройство зрения, аллергию). Кроме того, несмотря на высокую степень очистки, не исключена вероятность переноса вирусов от животных к людям. И, наконец, число больных диабетом растет так быстро, что обеспечить всех нуждающихся животным инсулином уже не представляется возможным. Заметим также, что это весьма дорогое лекарство.
Разработка технологии производства искусственного инсулина является поистине триумфом генетики. Сначала Ф. Сэнгер в 1955 г. с помощью специальных методов определил строение молекулы этого гормона, состав и последовательность аминокислот в ней. В 1963 г. молекулу инсулина синтезировали с помощью биохимических методов. Однако осуществить в промышленном масштабе столь дорогостоящий и сложный синтез, включающий 170 химических реакций, оказалось сложно.
Поэтому упор в дальнейших исследованиях был сделан на разработку технологии биологического синтеза гормона в клетках микроорганизмов, для чего использовали весь арсенал методов генетической инженерии. Зная последовательность аминокислот в молекуле инсулина, ученые рассчитали, какой должна быть последовательность нуклеотидов в гене, кодирующем этот белок, чтобы получилась нужная последовательность аминокислот. «Собрали» молекулу ДНК из отдельных нуклеотидов в соответствии с определенной последовательностью, «добавили» к ней регуляторные элементы, необходимые для экспрессии гена в прокариотическом организме Exoli, и встроили данную конструкцию в генетический материал этого микроба. В результате бактерия смогла вырабатывать две цепи молекулы инсулина, которые можно было в дальнейшем соединить с помощью химической реакции и получить полную молекулу инсулина.
