Новые храмы по традиции были поставлены на месте своих предшественников, первых московских белокаменных церквей времён Ивана Калиты и Дмитрия Донского, и были посвящены тем же христианским праздникам и святым. Из старых соборов в новые бережно перенесли все захоронения, священные сосуды, книги, иконы. Из Владимира в Успенский собор Кремля была принесена особо почитаемая русская святыня — икона Владимирской Богоматери, что подчёркивало духовную связь Москвы с древней столицей и ставило её под особое покровительство Богоматери.
В 1485–1495 годах итальянские мастера возвели новые стены и башни Кремля и иностранные путешественники часто стали называть его «замком». Действительно, форма башен и корона венчающих стены зубцов напоминают замок Скалигеров в Вероне и знаменитый замок Сфорца в Милане. Но это сходство чисто внешнее. Замки Европы, как правило, были недоступны для горожан, не были для них убежищем или центром общественной жизни. В отличие от них Московский Кремль, выстроенный по последнему слову европейской фортификации, прежде всего был крепостью, защищавшей всех жителей города. А поскольку там были сосредоточены высшая светская и духовная власть, наиболее почитаемые храмы, монастыри и общерусские христианские святыни, Кремль стал осознаваться как место «особой государственной святости» для всей России.
В 1547 году в Успенском соборе Кремля великий князь московский Иван IV официально принял титул царя, что соответствовало самодержавной форме его правления. Глава русской церкви митрополит Макарий после торжественного богослужения возложил на главу правителя России знаменитую шапку Мономаха.
Со времени венчания Ивана IV на царство церемониал придворной жизни приобрёл особое значение, будь то вступление на престол или приём иноземных послов, парадный царский выезд на охоту или смотр войск. Его нормы складывались под воздействием теории государственной власти и должны были способствовать её укреплению.
Стремление обосновать избранность «Московского царства» и его правителя послужило причиной канонизации большого числа исторических деятелей и подвижников церкви, в результате чего Россия в XVI веке обрела больше святых, чем за все предшествующие века своего существования. Эта же идея легла в основу программы украшения монументальной живописью кремлёвских соборов и создания целого ряда литературных произведений. Среди них особое место занимает Лицевой летописный свод — обширная историческая хроника, в которой события излагаются от сотворения мира до времени царствования Ивана Грозного. Почти каждую страницу свода украшают изящные миниатюры. Всего их более шестнадцати тысяч, и многие из них запечатлели реальные архитектурные памятники древнего Кремля.
Авторитет России и её самодержца значительно возрос после покорения в 1552 и 1556 годах Казанского и Астраханского ханств, возникших в XV веке в результате распада Золотой Орды. Величественным памятником этих событий стал собор Покрова Богоматери 1555–1561 годов, более известный как храм Василия Блаженного. Особая значимость храма-монумента была подчёркнута его строительством вне стен Кремля, но недалеко от его главных Спасских ворот, где начал складываться новый общественный центр Москвы — Красная площадь.
В 1563 году, в ходе Ливонской войны, был возвращён в состав Московского царства древний русский город Полоцк. С триумфом вернувшись в Москву, Иван Грозный приступил к перестройке своего домового храма Благовещения. В 1563–1566 годах над галереями собора были возведены четыре небольших церковки (придела). Их посвящения были связаны с идеей божественного покровительства первому русскому царю и его воинству. В результате Благовещенский собор стал своеобразным храмом-монументом, подчёркивающим значение Москвы как нового центра православия.
В период правления Ивана Грозного в Кремле формируются приказы — органы центрального управления. Здания приказов расположились на Ивановской площади Кремля, что придало ей значение делового и административного центра страны. Главным среди них был Посольский приказ, ведавший вопросами внешней политики и следивший за соблюдением посольского обряда. Кроме того, появились приказы, ведавшие сложным дворцовым хозяйством, хранилищами и мастерскими. Они располагались в каменных палатах на территории Государева двора. Первое летописное свидетельство об основных царских хранилищах датируется 1547 годом. В рассказе о случившемся тогда в Кремле страшном пожаре летописец перечисляет Казённый двор с царской казной, Оружейную палату, Постельную палату с казной и царские конюшни.
Утверждение царской власти шло параллельно с укреплением позиций Русской православной церкви. В 1448 году впервые митрополит Иона был избран в Кремле на соборе русских епископов без санкции Константинополя. Тем самым русская церковь обрела самостоятельность (автокефалию).
В 1589 году, во время правления сына Ивана Грозного царя Фёдора Иоанновича, в России было учреждено патриаршество. Первым русским патриархом стал Иов. К нему перешли древние владения митрополитов в Кремле, территория которых была значительно увеличена и застроена новыми каменными палатами и церквами. Двор главы русской церкви стал вторым по значению в Московском Кремле, что соответствовало положению двух «избранных богом» правителей России — царя и патриарха.
В недолгие годы царствования Бориса Годунова особое место среди задач его внутренней политики было отведено развитию и строительству русских городов. Эти усилия принесли определённые результаты, о чём можно судить по самым ранним планам Москвы и Кремля, которые относятся ко времени правления Бориса Годунова.
Началом 1600-х годов датируется «Кремленаград» — удивительный по красоте и точности изображения план Кремля. Он показывает, как улицы Москвы, пройдя через Спасские, Никольские, Троицкие ворота Кремля, продолжают своё движение к его центру, где вливаются в Соборную и Ивановскую площади. План передаёт характерные черты кремлёвских дворов — их замкнутый характер, расположение всех входов в здания со стороны двора, выделение его парадной и хозяйственной половин.
Неизвестный автор явно любуется разнообразием и выразительностью архитектурных форм. Интересно, что в поле его зрения вошли только каменные сооружения и что, при всей достоверности, он слегка акцентирует здания, возведённые царём Борисом. Обширностью и уникальностью каменных строений привлекает внимание Цареборисов двор, где жил Годунов до его избрания на царство. На территории Государева двора, который к этому времени занял всю юго-западную часть Кремля, хорошо виден Запасной дворец, построенный при Борисе Годунове. Он выстроен в форме очень значительного по размеру каре, южная сторона которого поставлена на высокий цокольный этаж, выполняющий одновременно роль мощной подпорной стены крутого холма. На «царицыной половине» двора отмечена Золотая палата, возведённая для царицы Ирины, сестры Бориса Годунова. На Ивановской площади расположились каменные здания приказов, также возведённые при царе Борисе. «Кремленаград» не даёт возможности рассмотреть их архитектурные формы, но в альбоме шведского инженера Э. Пальмквиста, приезжавшего вместе с королевским посольством в Москву в 1674 году, дважды воспроизведён Посольский приказ. Видимо, это светское здание конца XVI века, построенное в стилистических традициях возрождения, казалось автору одним из наиболее выразительных в Кремле.
Борис Годунов связывал с Кремлём и более широкие градостроительные планы. В 1600 году колокольня Ивана Великого получила ещё один ярус звона, и её высота достигла восьмидесяти одного метра. Москва нуждалась в подобной вертикали, способной зрительно объединить огромный город. Не лишено оснований предположение о том, что надстройка колокольни была первым этапом осуществления идеи царя Бориса возвести в Кремле подобие Иерусалимского храма. Его предполагаемые размеры, возможно, и вызвали увеличение высоты столпа. Но этот замысел не был воплощён. Надпись золотыми буквами под главой колокольни увековечила имя Бориса Годунова и его наследника — сына Фёдора.
Но основать новую династию Борису Годунову не пришлось — слишком сильны были его противники, знатные семейства князей Шуйских и бояр Романовых.
После смерти царя Бориса в 1605 году в России началась ожесточённая борьба за власть. Она сопровождалась заговорами, появлением царей-самозванцев и иностранной интервенцией. Период 1605–1612 годов вошёл в историю под названием Великой Смуты.
В 1612 году народное ополчение во главе с князем Дмитрием Пожарским и купцом из Нижнего Новгорода Кузьмой Мининым после упорных боёв с поляками, длительной осады Китай-города и Кремля освободило Москву от интервентов. По свидетельству современников, перед вошедшими в Кремль предстала картина полного запустения. Церкви были ограблены и осквернены, значительно пострадала царская сокровищница, все деревянные постройки были разобраны на дрова и сожжены. Всем миром москвичи стали расчищать кремлёвский холм от всего, что напоминало о захватчиках.
