Выделением и очисткой пенициллина занялась в 1932 году группа химиков под руководством Райстрика. Он был по тому времени одним из самых квалифицированных химиков, выделившим и изучившим уже некоторые другие соединения, продуцируемые микроскопическими грибами. Но после предварительной очистки пенициллина химики отказались от дальнейших попыток получить его в абсолютно чистом виде, поскольку при применении обычных методов он начинал разлагаться. Несколько лет спустя Флори спросил Райстрика, почему он так и не довел изучение пенициллина до конца. Тот ответил, что его интересовала лишь химическая структура таких легко кристаллизующихся биогенных продуктов.
В упомянутом докладе Флори была и такая, кажущаяся резкой фраза: «Открытие пенициллина не явилось плодом каких-нибудь новых научных идей».
Многие критики утверждали даже, что открытие Флемминга было чисто случайным. Против них выступил сподвижник Флемминга Ф. Бустинза-Лахиондо из Мадридского университета:
«.. Говорят о случайности этого открытия, но мне бы хотелось напомнить высказывание Пастера о том, что случай обычно подготовлен определенным ходом мыслей. Нельзя отрицать, что он играет в научной работе немалую роль в качестве какого-то непредвиденного явления. Но кто способен оценить это явление? Его может правильно интерпретировать только зрелая мысль. Многие люди не подготовлены к пониманию природных явлений, и только отдельные личности, воспитанные в повседневном напряжении поиска и одаренные тонким аналитическим интеллектом, наделены даром понимать страницы удивительной книги природы, всегда открытой для тех, кто умеет ее читать.
И плесень Флемминга была лишь эпизодом в процессе открытия пенициллина, исходным пунктом целой серии исследований. Сколько раз чашки с микробной культурой засорялись посторонней инфекцией, не привлекавшей, однако, ничьего внимания?
Но бактериолог больницы Св. Марии был прирожденным исследователем, его мысль была подготовлена к тому, чтобы заметить даже незначительные изменения в колониях выращиваемых микробов. Потому он и выбрал чашку, засоренную плесенью, и, изучая ее, с изумлением заметил, что колонии стафилококков в непосредственной близости от гриба развиваются хуже, чем другие, дегенерируют. Таково было начало истории пенициллина».
Сам Флемминг говорил так: «Конечно, все бактериологи встречались с фактом загрязнения культур микроскопическими грибами. Вполне вероятно, что какой-нибудь другой микробиолог заметил бы, как и я, подобные изменения, но верно и то, что, не имея специального интереса к поискам естественных бактерицидных веществ, он скорее всего отложил бы эту чашку в кучу посуды для мытья».
Мы же можем лишь отметить, что в 30-х годах пенициллин был почти забыт. В те же годы были открыты и получены в чистом виде еще несколько антибиотиков, выделенных из плесневых грибов, но они были вскоре оттеснены победным наступлением сульфаниламидов.
Дело продолжается в Оксфорде
Эстафету дальнейшего изучения пенициллина приняла в 1939 году группа исследователей с кафедры патологии Оксфордского университета: Г. У. Флори, Э. Б. Чейн и Н. Г. Хитли с несколькими сотрудниками.
Флори еще в 20-х годах в Кембридже, а затем и в Шеффилдском университете исследовал лизоцим. Попав в Оксфорд, он вместе с Чейном изучал его действие. А поскольку Чейн интересовался антибактериальными веществами, у них была собрана вся литература об известных в то время антибиотиках. Чейн предложил Флори заняться изучением их свойств. Для исследований были выбраны три вещества, одним их них был пенициллин. Хотя Райстрик и характеризовал его как вещество неустойчивое, Чейн нашел в статье того же автора указание о том, что раствор пенициллина сохраняет свою активность в течение нескольких месяцев. Поэтому Флори счел возможным попытаться получить его в чистом виде. Так была намечена ближайшая задача.
Скоро к Флори и Чейну присоединился Хитли, исследовавший условия выращивания Penicillium notatum в жидкой среде, в которую гриб выделял пенициллин. Исходя из опытов Райстрика, Хитли предложил основные методы выделения, которые с применением более совершенной техники используются и в наше время. Он разработал широко известный ныне метод определения содержания пенициллина, количество которого измеряется точно установленными «оксфордскими единицами».
В самые тяжелые военные годы эти ученые получили первые сотни миллиграммов «сырого» пенициллина, использованные ими для изучения его химических и бактерицидных свойств, а также для первых опытов на животных. Этот сырой препарат, содержавший, как было позднее установлено, не более 1 % (!) пенициллина, оказался лишь в ничтожной степени токсичным для животных, но при этом отличался сильным бактерицидным действием. Было показано, что при введении под кожу он затем выделяется с мочой, а это означало, что он попадал в цикл кровообращения и в почки. Этот факт, взволновавший ученых, открывал новые перспективы его применения.
Продолжались и его химические исследования. Успешные результаты были получены Д. Ходжкин, установившей при помощи рентгенографии структуру пенициллина.
Почему так важно было выяснить прежде всего его структуру? Исследования открывали путь к более дешевому синтетическому способу получения пенициллина. Но хотя через несколько лет этот синтез был осуществлен, он оказался дорогостоящим. Поэтому даже сегодня пенициллин получают с помощью микроскопического гриба Penicillium.
12 февраля 1941 года пенициллин был испытан на первом пациенте с тяжелым стафилококковым заражением. Потом последовали другие — и вот пенициллина уже не хватает. Однако ученым повезло. Оказалось, что его можно вторично получать из мочи пациентов, причем в более чистом виде, чем тот, который вводят.
Впервые это было показано на примере больного полицейского из Оксфорда. Со свойственным англичанам чувством юмора студенты-медики Оксфордского университета заметили: «Коллеги! Стоит заинтересоваться пенициллином. Это же замечательное вещество! Оно порождается плесенью, а очищается пропусканием через кишки оксфордских полицейских!»
Между тем в Оксфорде стали ощущаться определенные трудности при продолжении исследований. И тогда Флори и Хитли отправились в Соединенные Штаты Америки, где вскоре наладили промышленное производство этого препарата.
Рождение новой промышленности
Флемминг и оксфордская группа ученых выделяли пенициллин весьма несовершенным способом. Жидкую питательную среду стерилизовали в колбах и засевали спорами гриба Peniclllium notatum. Споры прорастали, через неделю на поверхности жидкой среды разрастался мощный слой мицелия гриба, после чего жидкость фильтровали. Содержание пенициллина в фильтрате было чрезвычайно низким — на миллион частей жидкости приходилась одна часть антибиотика. Из 1 л культуральной жидкости можно было получать лишь 1 мг, а из 10 гл — 1 г пенициллина. Такие ничтожные количества вещества ограничивали перспективы использования антибиотика.
Позднее, уже в США, для культивирования гриба стали применять бутылки из-под молока. При этом появилась возможность использовать аппаратуру молочного производства для дозирования питательной среды, мытья и стерилизации посуды. На самом крупном предприятии использовали до 750 000 бутылок. Если считать, что каждая бутылка содержала пол-литра питательной среды, то после одного производственного цикла (375 000 л) можно было получить 375 г пенициллина. Но этого было недостаточно. Находясь в Соединенных Штатах Америки, Флори и Хитли предложили метод так называемого глубинного культивирования. По существу это был тот же самый метод, который использовался при производстве дрожжей. Большие сосуды наполняются стерилизованной жидкой средой, в которую засевают определенное количество культуры дрожжей. При постоянном перемешивании и в притоке стерильного воздуха происходит размножение дрожжей во всем объеме сосуда.
При аналогичном выращивании продуцента пенициллина необходимо было, однако, решить ряд технических вопросов. Пожалуй, самым важным из них был вопрос о том, как предотвратить проникновение в большие емкости, предназначенные для роста и размножения Peniclllium notatum, других, нежелательных микроорганизмов.
Эта проблема была решена в 1943 году. Главными поборниками внедрения новых методов в производстве пенициллина были Когхилл и его сотрудники; они нашли способ многократного увеличения продукции пенициллина. Для этого в питательную среду добавляли кукурузный экстракт, который являлся отходом при получении кукурузного крахмала и содержал вещества, не только ускорявшие рост гриба, но и стимулировавшие синтез пенициллина.
